[发明专利]一种融合蛋白、制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种融合蛋白、制备方法及其应用。一种融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、连接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通过连接肽与Hsp27蛋白连接。本发明所述融合蛋白可以应用于肿瘤防治药物制备中，具有特异性好、抗原高效等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌是三种恶性肿瘤严重威胁女性生命健康，五年存活率不足50％，子宫颈癌发病率居女性生殖系统肿瘤之首，我国新发病例每年高达15万之多，而且有明显的年轻化趋势，国家已经广泛开展“两癌筛查”，但是仍然未能改善肿瘤患者的预后，女性生殖系统恶性肿瘤是我国中长期科技发展纲要计划攻关的恶性肿瘤之一。女性生殖系统恶性肿瘤的传统治疗为手术、放疗、化疗，但是仅仅有一定疗效，对于晚期或复发患者均不能奏效，目前急需寻找新的治疗方法。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种融合蛋白、制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、连接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通过连接肽与Hsp27蛋白连接。

采用上述方案的有益效果是:

发明人通过蛋白质组学，免疫组化，RT-PCR，western blot等研究方法，发现CLIC1(细胞内氯离子通道蛋白1，氯离子通道蛋白是一组调节基本细胞功能的蛋白，包括细胞膜电位稳定、跨膜转运、维持胞内pH，调节细胞容积)在卵巢癌组织中呈现高表达，CLIC1被发现和细胞周期相关，在细胞G2/M期表达于细胞膜上,应用CLIC 1特异性拮抗剂阻断该离子通道后，细胞的有丝分裂受到影响，细胞周期停滞于G2/M期，推测CLIC1在卵巢细胞周期中参与了调节这一过程，发明人进一步通过建立CLIC1基因敲降和过表达的细胞系，在体外试验中证实CLIC 1在SKOV3和A2780卵巢癌细胞系中呈现高表达，抑制CLIC1的表达可以减少卵巢癌细胞系的增殖及浸润，提示CLIC 1可能是参与卵巢癌发生及淋巴道转移的重要基因之一，在此前国内外均尚未见相关报道。

进一步，发明人将CLIC1基因和人HSP27基因(热休克蛋白27，属于低分子量热休克蛋白家族的成员，HSP27是一个涉及到药物抗性、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，HSP27介导的这些功能可能与其对其它蛋白质的影响有关)通过一段柔性连接肽进行人工融合，合成一种CLIC1-HSP27的融合基因，采用基因联合优化技术在原核表达系统中成功实现了该融合基因的高表达，通过质谱鉴定和亲和层析纯化获得了纯度大于90％的CLIC1-HSP27融合蛋白，该融合蛋白标准品成功解决现有肿瘤细胞裂解物成分复杂，无法保证所诱发抗肿瘤免疫的强度和特异性的缺点，并且成分单一，结构明确，降低成本，方便于工业化生产，为以后的生物学研究打下基础，非常具有应用前景。

进一步，所述融合蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

采用上述方案的有益效果是：有现有技术进行改进，摸索出基因联合优化技术，从密码子优化，mRNA结构优化，基因表达优化三方面联合入手，通过对稀有密码子、mRNA结构、表达菌株的筛选、纯化的温度、诱导度、培养基OD值探索，提高外源基因的表达效率、可溶性和稳定性，提升表达产量和准确性，后期质谱测序与原始预测序列在存在误差的情况下符合率接近100％，传统技术一般为60％-80％左右。

进一步，所述连接肽为柔性连接肽。

采用上述方案的有益效果是：

采用柔性的连接肽有利于：增加产物的稳定性，选甘氨酸作为融合蛋白linker是因为甘氨酸是所有氨基酸中最小且没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥，采用的linker不能太大，否则一是对结构有影响，二是增加了融合蛋白的抗原性。