[发明专利]一种蛋白质色谱分离平台及其应用

权利要求书

1.一种蛋白质色谱分离平台在细胞、组织或者血液样品的蛋白质鉴定和蛋白质定量分析中的应用，其特征在于，所述的蛋白质色谱分离平台包括蛋白质组反应器(1)与液相色谱-质谱仪(2)；

其中，所述蛋白质组反应器(1)包括移液枪枪头(3)、强阴离子交换树脂(4)和固相萃取膜(5)；固相萃取膜(5)填充于移液枪枪头(3)的下端，强阴离子交换树脂(4)填充于移液枪枪头(3)下端并位于固相萃取膜(5)之上；

所述的蛋白质色谱分离平台的应用为：将生物样本中的蛋白质样品在强阴离子交换树脂上进行酶解和强阴离子交换分级，完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上进行高pH值反相分级，再将多肽转移到液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，实现三维分离，包括以下步骤：

(1)细胞或者组织样品经裂解液裂解并碱化后，加到预先活化好的蛋白质组反应器中，通过离心使蛋白质富集到强阴离子交换树脂上；

(2)使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到固相萃取膜上的表面活性剂，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原、烷基化和酶解；

(3)使用不同pH值的溶液按pH值从高到低的顺序将生成的多肽从强阴离子交换树脂上依次转移到固相萃取膜上，进行强阴离子交换分级；

(4)除盐后，使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次将多肽洗脱下来，进行高pH值反相分级；

(5)使用液相色谱-质谱仪对多肽样品进行低pH值液相色谱分离检测。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述强阴离子交换树脂(4)为含有季铵基的树脂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固相萃取膜(5)为C₁₈膜。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述不同pH值的溶液按pH值从高到低时使用溶液的pH值从pH12到pH2。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述高pH值反相分级时使用溶液的pH值高于8。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(5)所述低pH值液相色谱分离的pH值低于3。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级和液相色谱-质谱兼容的。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂为正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、胆固醇琥珀酸单酯三羟甲基氨基甲烷盐中的任意一种或两种的混合物。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液，其中，乙腈和/或甲醇在所述溶液中的体积含量为20％，柠檬酸钾在所述溶液中的浓度为8mmol/L。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。