[发明专利]一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种铜绿微囊藻毒素(Microcystin)粗提液的制备方法。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类具有生物活性的环状七肽化合物，为分布最广泛的肝毒素。主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)产生。水体中的微囊藻毒素多达70余种，其中在水体中，存在较普遍而且毒性较大的微囊藻毒素有三种，它们分别是MC‐LR、MC‐RR、MC‐YR，其中L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸三种氨基酸。

近年来，由于自然水体水华频发，严重影响到人民群众的正常生产生活，伴随着水华而产生的微囊藻毒素的生态威胁也引起了研究人员的广泛关注。在这种情况下，选择哪种含有藻毒素成分作为实验材料，如何尽可能真实地模拟实际水体中藻毒素对其他生物以及生态的影响，直接决定了实验结果的客观准确性和学术价值。目前，大多数研究人员选择购买高纯度的藻毒素标准品来模拟自然条件的水环境状态。

市面上所售藻毒素标准品虽然能够满足藻毒素研究人员对纯度的要求，但普遍价格昂贵。另外，藻毒素并不是铜绿微囊藻细胞破胞后释放到水体中的唯一物质，藻毒素的存在往往伴随着其他多种胞内容物。因此如果想要模拟自然条件下藻毒素对其他生物和生态的影响，或者考虑藻毒素和其他胞内容物的协同作用，仅使用微囊藻毒素标准品并不能满足研究要求。

藻毒素粗提液作为高浓度微囊藻细胞破胞后的产物，相比于藻毒素标准品有很大区别。首先，藻毒素粗提液中不仅含有较高浓度的藻毒素成分，同时还包含了藻细胞破胞后释放到水体的其他内容物。其次，藻毒素标准品中可能含有甲醇等有机溶剂，在应用到实验中时，将会对实验结果造成干扰。因此，藻毒素粗提液相比藻毒素标准品能够更好地还原实际的水环境状态，实验结果也能够更真实地突出反映在其他胞内容物存在的情况下，铜绿微囊藻毒素对水生生物的影响。

本发明旨在获取一条便捷、快速有效的铜绿微囊藻毒素粗提液制备方法，即在富集了藻毒素的同时，保留伴随藻细胞破胞而产生的所有物质，在最大程度上还原自然状态下藻毒素与其他物质的存在状态。

发明内容

传统藻毒素提取技术路线主要是超声破胞‐离心‐固相萃取法。这种方法虽然能较好地去除其他杂质，但步骤繁琐、操作比较复杂，单一样品的处理时间较长，效率比较低，且最终得到的产物以甲醇等物质为溶剂，对后续实验可能造成干扰。而市售藻毒素标准品虽然纯度很高，但价格也相当昂贵，造成实验成本极高。另外，无论是传统技术提取的藻毒素，还是市售藻毒素标准品，都不能模拟自然状态下藻毒素与其他胞内容物的协同作用，因此给想要研究自然条件下藻毒素对其他生物和生态影响的科研人员增加了难度。本发明简化了传统方法的步骤，并对其进行有针对性的改良，杜绝了有机溶剂的引入。另外，本方法在富集了藻毒素的同时，将藻细胞破胞后的其他物质最大程度地保留下来，基本可以满足实验的要求。

本发明的技术方案如下：

一种铜绿微囊藻毒素粗提液的制备方法，先离心富集藻细胞，然后再进行超声破胞。取处于对数生长期的M.aeruginosa藻液，分装于多个离心管中，使用冷冻离心机在4℃，3000‐8000rpm下离心分离；倒出上清液，使藻细胞聚集物留于离心管底部及壁上；继续向离心管中倒入相同体积的藻液，使用冷冻离心机离心并重复上述操作；然后使用超声细胞破碎仪在300‐800W的条件下超声破碎，得到藻毒素粗提液。

所述冷冻离心机转速在3000‐8000rpm，时间在10‐30min。

所述超声细胞破碎装置功率在300‐900W，时间10‐30min。

优选3000‐8000rpm下离心分离15‐30min。

优选300‐800W的条件下超声破碎15‐30min。