[发明专利]筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法。本发明公开了鉴定高二羟基儿茶素茶树植物的功能标记，将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有高二羟基儿茶素的茶树植物材料，从而加快优质茶树品种的育成步伐。本发明对利用分子标记辅助选择高二羟基儿茶素茶树品种具有重要的理论意义和经济价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法。

背景技术

儿茶素类（catechins）是茶树茶类黄酮（flavonoids）的主体成分，占绿茶干重的8-26% (Chen Zhou, 2005)，成茶的几乎所有特性如滋味、汤色和香气等都直接或间接与儿茶素有关（Wang et al., 2000）。儿茶素具有抗氧化、抗诱变、抗癌、抗心血管疾病、紫外线辐射保护作用、抗糖尿病、抗菌消炎、减肥和帕金森病的治疗等作用（夏涛和高丽萍,2009），属于黄烷-3-醇类化合。儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根据儿茶素B环的羟基数目、C环上2,3位同分异构体、C环上3位是否连接没食子酸等可以划分为若干种组分。根据儿茶素B 环的羟基数目，儿茶素主要可以分为B环双羟基和三羟基儿茶素，其中表儿茶素(EC) 和表儿茶素没食子酸酯(ECG) 属于B环二羟基儿茶素，而表没食子儿茶素(EGC) 和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 属于B 环三羟基儿茶素。类黄酮3′,5′-羟化酶(flavonoid 3′,5′- hydroxylase，F3′5′H)是茶树黄烷-3-醇合成中的重要酶类。F3′5′H属于CYP75A 亚家族，可以分别催化黄酮、黄烷酮、二氢黄酮醇和黄酮醇转化为3′,4′,5′三羟基化产物，是目前已知的细胞色素P450家族中催化B-环5′羟基化反应的唯一酶系。

在红茶发酵过程中，每个茶黄素分子的形成需要1个二羟基儿茶素和1个三羟基儿茶素，因此含有等浓度的二羟基儿茶素和三羟基儿茶素的鲜叶原料最有利于形成高品质红茶。但专利申请人在2010年和2011年对403份茶树资源儿茶素组分进行了系统鉴定，发现与肯尼亚等主产红茶国家相比，我国不乏高儿茶素资源，但EGCG占儿茶素总量的比例很高，平均为59.3–61.3% （Jin et al., 2014），远高于肯尼亚（所有品种都在32%以下）（Owuor Obanda, 2007），而二羟基儿茶素ECG和EC含量较低。因此，今后我国茶树品种的改良，特别是红茶的品种选育，需要筛选和利用高二羟基儿茶素的茶树资源，进而培育高品质的红茶品种。

迄今为止，国内外茶叶儿茶素含量鉴定大都采取生化测定方法。该方法需要一定数量茶树叶片，鉴定的植株需要长到3-4年后才能鉴定，耗费时间过长，效率低下。此外，鉴定植株的儿茶素含量受栽培环境和茶树树龄影响很大，需要多年、多点鉴定才能做到精准评价。随着分子生物学技术的迅速发展,分子标记辅助选择(MAS)被广泛应用于分子育种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早期选择和预测，大大缩短了茶树育种年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法的技术方案。

所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在筛选具有高二羟基儿茶素茶树中的应用，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在筛选具有高二羟基儿茶素茶树中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：