[发明专利]一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法

说明书

本发明涉及一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法。所述的方法分为两条路线：路线A和路线B。其中，路线A是把蛋白酶解产生的肽段与碘乙酰胺的小球孵育，对巯基肽段和硫巯基肽段进行富集后；通过还原剂将硫巯基肽段的二硫键还原释放，进而用可断裂的同位素亲和标签标记释放下来的硫巯基肽段，最后使用裂解液将可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂。路线B是用可断裂的同位素亲和标签标记含巯基和硫巯基的蛋白、蛋白酶解、亲和富集巯基肽段和硫巯基肽段；最后用裂解液将连接在巯基肽段和硫巯基肽段上的可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂。该方法具有选择性好、假阳性低等优点，可实现复杂蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段的定性与定量。

技术领域

本发明涉及一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法及其在细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段分析中的应用。

背景技术

20世纪90年代后期,H₂S被证实是存在于体内的第3种新型的内源性气体分子，广泛参与机体多种生理与病理过程。目前研究表明，蛋白质的硫巯化翻译后修饰(将活性R-SH转化为R-SSH)是H₂S信号传导的一个重要生物学途径之一。蛋白的硫巯化修饰在体内是普遍存在的，一些重要的蛋白质已被确认发生了硫巯化修饰，如：生理条件发生的Parkin-SSH能增强其泛素化活性，有利于帕金森疾病的治疗(Nat.Commun,2013,4,1-6)；抗凋亡转录因子(NF-κB)亚单元p65-SSH可以诱导抗凋亡基因的转录(Antioxid.Redox.Signal.,2014,21,2531-2541)。在组学水平大规模分析鉴定硫巯化蛋白/肽段有助于H₂S信号通路的深入研究。然而，作为亲核试剂,R-SSH的性质与R-SH类似；作为亲电试剂，R-SSH的性质与R-SS-R类似；加之R-SSH的内在不稳定性导致富集鉴定存在较大的困难。目前，硫巯化蛋白/肽段的富集鉴定方法多采用间接法，丢失了硫巯化的位点信息，造成了一定的假阳性。因此，发展直接的硫巯化位点的富集鉴定策略十分必要，同时结合组学定量技术对硫巯化位点进行大规模定性定量分析将是硫巯化翻译后修饰的发展趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种规模化定性与定量分析复杂样品中硫巯化肽段的方法。为实现该目的，本方法采用的技术方案为：

(1)将碘乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过共价反应固载到带氨基的小球上。小球的基质为硅球、聚合物微球、四氧化三铁磁性纳米颗粒。反应得到的是碘乙酰胺的硅球、碘乙酰胺的聚合物微球、碘乙酰胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒。反应体系为：在甲醇和磷酸盐缓冲盐中避光振荡反应0.5-24小时。其中甲醇加入量为总体积的30％-60％，磷酸盐缓冲盐浓度为0.01-0.1M,pH为7.5-8.5。

(2)将蛋白酶解产物与带有碘乙酰胺的硅球、碘乙酰胺的聚合物微球、碘乙酰胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐中(0.01-0.1M，pH7.5-8.5)孵育3-12h以富集巯基肽段和硫巯基肽段，使用30-60％的乙腈和0.5-2M的氯化钠洗涤去除非特异吸附。

(3)使用还原剂三(2-羧乙基)膦/二硫苏糖醇将固定到材料上的硫巯基肽段还原切断进而释放，其中三(2-羧乙基)膦/二硫苏糖醇的浓度为1-100mM，37℃还原，反应时间为30-120min。

(4)将还原洗脱下来的肽段用5-100μL的可断裂的同位素亲和标签进行标记，反应体系为0.01-0.1M，pH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，收集标记后的肽段。

(5)将标记后的肽段使用50-90μL的95％的三氟乙酸和5％的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃孵育2h进行酸裂解，收集裂解后的肽段，进行液质联用质谱鉴定。将鉴定得到的肽段二级质谱信息生成参考库。