[发明专利]一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，包括功能化磁珠的制备、脲酶功能化金纳米探针的制备以及标准溶液和样品中CEA含量的检测，该方法也可用于检测甲胎蛋白（AFP）、胰胚胎抗原（POA）、同工酶（NSE）、激素（HCG）等；本发明方法具有操作简单，成本低廉，反应快速的特点，对待测物的定量检测仅需通过肉眼或者简单的紫外‑可见分光光度计即可进行，因而对推广比色免疫分析在临床诊断、医药分析和食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及比色免疫分析技术领域，具体是一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法。

背景技术

免疫分析是一种基于抗原-抗体之间的高特异性免疫识别作用而发展起来的高选择性、高灵敏分析方法。免疫分析的理论基础是抗原-抗体之间的特异性反应，即免疫反应。比色免疫分析一般利用抗体或抗原来作为生物敏感元件，在将其固定于某些载体表面后，通过载体表面的抗原-抗体免疫反应来定量捕获示踪标记物，再利用示踪标记物与特定检测试剂生成有色化合物的显色反应为基础，凭借肉眼或紫外-可见分光光度计等简单仪器来比较或测量有色物质溶液深度来建立起定量分析关系，从而实现对特定的靶向分析物的准确检测。

癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)是一种存在于结肠癌、正常胚胎肠道、胰腺和肝内的一种蛋白多糖复合物。可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后是一个较好的肿瘤标志物。

目前，检测肿瘤标志物普遍采用的是电分析化学和荧光、化学发光、电致化学发光等光学免疫分析方法。与这些方法相比，比色免疫分析所使用的仪器更加简单，且可与磁珠分析平台相结合，操作更加方便、高效。传统比色免疫分析主要采用基于金/银纳米粒子聚集和基于酶/模拟酶催化底物显色反应这两种比色检测策略，前者灵敏度一般较低，后者在酶催化反应中通常面临着检测试剂较为昂贵，显色稳定性较差等缺点。因此，建立一种成本更加低廉，灵敏度更高，且可方便、快速检测肿瘤标志物的免疫分析方法是本技术领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是针对目前检测肿瘤标志物的仪器昂贵、操作繁杂、检测试剂成本高等问题，提供一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，该方法操作简便，成本低廉，不需要昂贵的仪器和试剂，灵敏度高，反应时间短。

本发明的一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，包括以下步骤：

（1）功能化磁珠的制备

取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.2M 的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液冲洗三遍后重新分散于400μL浓度为50mM，pH=6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（2）脲酶功能化金纳米探针的制备