[发明专利]猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明根据SRV‑1病毒、SRV‑2病毒、SRV‑3病毒以及SRV/D‑T病毒基因保守序列设计检测引物和检测探针，建立了猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测方法。本发明相较于其它检测方法具有更高的灵敏度和特异性。可同时检测大量样品且成本低，适合于大规模的猴场SRV病毒检测。SRV病毒精确的检出率将为选取食蟹猴和猕猴进行科学研究提供可靠的背景资料，同时也有助于提前发现和隔离SRV病毒携带猴。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

食蟹猴和猕猴被广泛应用于病理学、实验动物学和药理学研究，在研究过程中实验猴携带D型逆转录病毒(simian type D retrovirus,SRV)会严重干扰实验结果，同时SRV病毒具有高传染性以及高致病性。以往对SRV病毒的检测，主要采用病毒分离和血清学法，如酶连免疫法(Elisa)、免疫荧光法等。这些方法在特异性、灵敏度、早期诊断方面各有其局限性。在以往的血清学诊断中据相关文献报道SRV病毒的血清学检测阳性仅为1％～4％，因些研究寻找灵敏度更高的检测方法势在必行。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

本发明的第一个目的是提供猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

SRV-F：5’-CTGGTCAGCCAATGACGGGTA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，SRV-R：5’-CGCCTGTCTTAGGTTGGAGTGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：

SRV病毒的探针：5’-AGAGAGTGACATTTCTCACTAAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

所述的荧光报告基团优选为TET、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团优选为TAMRA或BHQ1。

本发明的第三个目的是提供含有上述的检测引物和/或检测探针的检测试剂盒。

优选，所述的检测试剂盒包括实时荧光定量PCR反应液、HotStart DNA聚合酶、上述的检测引物和检测探针。

本发明的第四个目的是提供非疾病的诊断和治疗目的的猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板；(2)使用上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及HotStart DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录检测样品的PCR扩增Ct值；(4)根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有猴SRV病毒。

步骤(2)所述的扩增反应体系优选为：模板DNA 5μL，10×TaqMan缓冲液2μL，5mMMgCl₂ 1.5μL，2.5U/μL HotStart DNA聚合酶1μL，2.5mmol/L dNTPs 1μL，20μmol/L SRV病毒的探针0.25μL，20μmol/L SRV-F和SRV-R各0.25μL，超纯水8.75μL。

步骤(3)所述的实时荧光定量PCR反应，其反应程序优选为：95℃30s；95℃5s，61℃31s，50个循环。