[发明专利]一种快速检测多西环素残留的核苷酸适配体探针试剂盒及其应用

说明书

本发明提供的快速检测多西环素残留的核苷酸适配体探针试剂盒，所述多西环素核酸适配体核酸探针以纳米磁球为内核，外表面键合有多西环素核酸适配体链；其中，多西环素核酸适配体链（多西环素核酸适配体人工序列）为：5’‑GTA CGG AAT TCG CTA GCC GGG CGG CAG GCC ACG GCT GGG GTT GGT CCC ACT GCG GAT CCG AGC TCC ACG TG‑3’；所述试剂盒适配体探针是多西环素的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

技术领域

本发明涉及对多西环素特异性识别DNA适配体的筛选方法及其应用，具体涉及生物技术和食品抗生素检测领域。

背景技术

多西环素(Doxycycline,)为四环素类抗生素(Tetracyclines)，通常用来治疗动物传染病，还被用作饲料添加剂，以预防疾病和促进动物生长。在实际工作中，由于随意加大使用剂量和不遵守休药期，造成药物在动物组织中残留。四环素类药物长期残留在动物组织中，导致耐药菌在人类之间传播，严重损害人体健康。很多国家和国际组织通过建立动物性食品中兽药残留的有效检测方法，来控制药物残留问题。如，我国和欧盟对Dox在动物组织中残留最高残留限量(MRL)作了明确规定：肌肉、肝脏和肾脏的MRL分别为100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。为了控制兽药残留，保障人类健康，有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。最近报道的检测多西环素(OTC)的方法主要包括高效液相色谱法、荧光法，质谱法和其它方法等。但是这些方法通常比较费时间并且价格相对昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高而不易推广。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质，在食品抗生素残留检测领域已较为广泛地应用。酶联免疫吸附测定(ELISA)将抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合，有效保证分析中的高选择性和高灵敏度，报道最多的是免疫分析方法。目前欧美已有一些公司生产针对抗生素残留检测的ELISA试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，只能检测少数种类常见的抗生素残留。由于多西环素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，需将其与生物大分子如蛋白质连接后作为载体的抗原决定簇刺激动物才能产生特异性抗体，生产与应用存在较多的限制，包括：抗原偶联合成，高效价抗体的筛选；产生于鼠、兔等动物的异源抗体在使用中有可能产生非特异性反应；抗体的制备成本高，费时费力，单克隆细胞株不易保存；批内批间检测性能不稳定。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在多西环素检测中的应用。

核酸适配体是近年来发展起来的一类经体外人工合成而筛选出的单链寡核苷酸，能高效、特异性地结合各种生物目标分子，核酸适配体的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的研究平台。核酸适配体具有自身稳定性好、制备合成相对简单、快速、易获得、易功能化修饰与标记等优点，因此，在生物传感器设计中应用灵活广泛。近几年，基于核酸适配体的生物传感器研究受到人们极大的关注。

目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中抗生素检测的报道，检测方法多以电化学生物传感器为主。本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需要制备抗体的缺点，建立了基于磁珠分离-适配体识别的荧光检测方法，可用于食品中多西环素残留的快速、高灵敏度检测。

发明内容

本发明筛选到可以与多西环素高亲和力结合的单链DNA适配体序列，建立了基于磁珠分离-适配体识别的荧光检测方法，可用于动物源性食品中多西环素残留的快速、高灵敏度检测。

本发明目的：在于提供一种测定多西环素的适配体的构建方法，鉴于多西环素分子的结构特点，设计了改良的磁珠SELEX技术优选多西环素的方法，借助基于SELEX的组合化学技术，筛选得到能特异性结合多西环素的DNA适配体。将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，与FAM标记的适配体互补链杂交，在不同的激发和发射波长下检测互补链上荧光标记物。当加入靶分子时，核酸适配体与靶分子特异性结合，导致与其互补杂交的荧光标记DNA短链的解离，引起荧光强度的变化来定量分析样品中多西环素。