[发明专利]一种等温解开双链DNA及制备单链DNA的方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，提供一种等温解开双链DNA的方法以及基于该方法制备单链DNA的方法。等温解开双链DNA的技术方案为利用重组酶结合单链DNA探针形成复合物，复合物识别双链DNA中与单链DNA探针同源的序列并侵入双链DNA，从而实现双链DNA的等温开链，随后单链DNA探针和双链中一条链互补配对，而单链结合蛋白结合另一条链稳定开链结构。基于该方案及单链DNA探针3’‑末端可以被连接酶和聚合酶等酶识别的特性，本发明还提出了制备单链DNA的方案，并详细介绍了通过连接酶或延伸酶制备单链DNA的方案。以上技术方案均可在等温条件下完成，且无需ATP循环系统，甚至ATP可被dATP替代，所用酶来源广泛、易于获得，为等温技术以双链DNA作为研究对象提供了一个通用平台。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及双链DNA的解链和单链DNA的制备，具体涉及一种普适的利用重组酶和单链DNA等温解开双链DNA的方法及用其制备单链DNA的方法。

背景技术

DNA是基因的载体，其携带的遗传信息编码了细胞内所有结构蛋白质和功能蛋白质的氨基酸序列。除少部分病毒外生物体内基因组几乎都以双链形式存在。然而，体外以DNA为基础的诸多基本操作如DNA杂交、连接、扩增等均利用的是探针或引物与目标DNA序列之间碱基互补配对的原理。因此，将双链DNA解开是所有DNA基本操作的前提以及后续如基因检测、测序、编辑等一系列应用的关键。常用解开双链的方法分为物理法和化学法。物理法主要是通过加热使两条单链分离的热变性法。而化学法主要是利用变性剂如尿素、强碱等破坏两条单链之间形成的氢键。这两种方法虽然使双链打开彻底，但是前者受到加热装置限制，不仅增加成本且降低了便携性，后者则因为反应条件太过剧烈且成分复杂而不适于酶促反应等诸多生化反应。因此，建立一种等温、便捷、经济且生物兼容性强的双链DNA解开方法具有重要的科学意义和实用价值。

由于大多数工作仅需针对基因组DNA中的部分序列进行研究，因此，对目标序列的提取当属首要任务。常用的技术为PCR扩增，但该技术需要热变性及反复的热循环，仪器依赖性高且操作复杂。随着目前对仪器设备便携性、经济性和快捷性的要求越来越高，人们更青睐于基于等温反应的技术和设备。然而大多数等温反应仅能以单链DNA为直接的研究对象，如极具代表性的等温基因检测技术——依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、链置换扩增技术(SDA)、滚换复制技术(LRCA和HRCA)、环介导核酸等温扩增技术(LAMP)等。目前用于获得单链的方法主要有：(1)利用热变性、内外引物及链置换相结合的策略。双链DNA热变性开链，引物与模板杂交后，外引物延伸过程中将内引物的延伸产物置换出来获得单链；(2)通过不对称PCR使双链产物的其中一条链线性积累；(3)通过内切酶将长的基因组模板切割成短的核酸片段，利用Lambda、ExoIII等外切酶降解双链中的其中一条链最终获得目的单链。其中方法(1)和(2)均无法摆脱热变性和加热设备，违背了等温反应的初衷；方法(3)虽然能避免对仪器的依赖，但是内切酶需要识别特异的序列，大大降低了其通用性。因此，亟需设计一种能够在等温条件下以双链DNA为模板制备单链DNA的通用方案，以配合快速发展的等温技术，建立系统完善的适用于广泛DNA样本的等温操作体系。

发明内容

本发明目的在于提供一种等温条件下解开双链DNA的方法以及利用此方法在不依赖昂贵仪器的情况下迅速、简便地制备单链DNA的方法，为等温反应技术能直接以双链DNA为研究对象提供一种通用的解决方案。

实现以上目的的技术方案如下：

一种等温解开双链DNA的方法，其技术方案为：针对双链DNA中的目的序列的一条链设计一段互补的单链DNA探针。在高浓度ATP或dATP存在的情况下，重组酶首先与单链DNA探针形成复合物，然后向体系中加入双链DNA和单链结合蛋白SSB；复合物扫描双链DNA，当遇到与单链DNA探针同源的区域时，双链DNA被解开，单链DNA探针与其互补链配对形成异源双链，另一条链与单链结合蛋白SSB结合形成稳定的开链结构。