[发明专利]检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述方法在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；然后根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值△Ct值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。本发明的方法操作简单和准确性高。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及检测角膜营养不良基因突变的基因型的方法及其试剂盒。

背景技术

角膜营养不良是一组原发性、遗传性、双眼具有病理组织特征改变的疾病，其共同特点为在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。目前报道与角膜营养不良相关的基因有多种，其中TGFBI基因是首个被发现且最为常见的相关基因，为常染色体显性遗传。在中国人群中，R555和R124为该基因上的突变热点，占所有突变的80％以上。

根据临床症状可将TGFBI基因突变引起的角膜营养不良分为3大类：1)格子状角膜营养不良(LCD)，包括：LCDI、LCDIII/IIIA、LCDIV和非典型LCD；2)颗粒状角膜营养不良(GCD)，包括：GCDI、GCDII(也称Avellino角膜营养不良，ACD)、GCDIII(也称Reis-Bucker角膜营养不良，RBCD)和非典型GCD；3)蜂窝状营养不良，也称Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)。其中，在中国人群中，R555W和R124H突变分别与GCD I和GCD II(ACD)表型具有明显相关性。

有研究报道，角膜营养不良(GCD)的患者进行激光视力矫正术或角膜表面的微小伤痕等刺激可导致病情迅速恶化，视力在1～3年后出现下降，甚至导致失明，尤其是GCDII(ACD)型患者。目前在韩国，已经禁止对ACD型患者进行激光类视力矫正术。至于激光视力矫正术是否会使其它两种类型的角膜营养不良患者病情恶化目前尚无准确报道。

部分角膜营养不良患者为杂合型突变，其症状不是很明显，常规检查很难发现角膜营养不良，如果这类患者经过近视激光手术之后将可能出现角膜混浊、视力下降等症状，而且目前没有有效的治疗方法。因此有必要通过基因检测确定被检者DNA中与角膜营养不良症相关的易感基因是否发生突变，从而对角膜营养不良症的临床诊断提供依据。基因检测比传统检查拥有更高的准确性和更远的前瞻性，可有效预防角膜营养不良症患者在进行激光视力矫正术后出现角膜混浊症状急速恶化的后果。

用于检测基因多态性的方法很多，包括如DNA直接测序，限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphisms,RFLP)，扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，所以临床应用受到很大限制。限制性片段长度多态性仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。

扩增阻碍突变系统是验证性检测DNA序列变化的常用经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA模板和一条相同的共有引物和反应条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3`末端与野生型模板匹配，突变型ARMS引物3`末端与突变型模板匹配，使两个反应选择性扩增特定的DNA模板，即3`末端不匹配引物的延伸受到阻碍，通常还在3`末端2-4个碱基设置一个错配碱基，以提高错配引物的选择扩增性。但由于人基因组DNA分子模板浓度一般较高，导致ARMS引物经选择性扩增后背景仍然很高，而且对于特定序列，ARMS引物不足以形成较明显的扩增差异，不利于结果判断。

发明内容