[发明专利]一种多诱导剂制备大鼠肝S9的方法

说明书

本发明提供一种多诱导剂制备大鼠肝S9的方法，包括步骤：(a)诱导剂以灌喂和腹腔注射的方式诱导大鼠；(b)断头处死大鼠，无菌条件下，清洗液冲洗肝中残血，取出肝脏；(c)按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的储存缓冲液重悬后再次低速离心取上清，合并上清经冷冻高速离心后收集上清，即肝S9；(e)检测依赖肝S9的诱变剂环磷酰胺对哺乳动物细胞的致畸变作用；本发明提供的大鼠肝S9制备方法显著提高了肝S9的酶活性。

技术领域

本发明属于蛋白酶学领域，具体涉及一种多诱导剂制备大鼠肝S9的方法。

背景技术

大鼠肝细胞S9是大鼠肝实质细胞匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶，其在药物体外代谢的研究中具有快速简便、灵敏、经济且可进行高通量筛选的特点，因此常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的工具。同时许多致癌剂的生物转化是依靠细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的，所以大鼠肝S9是许多体外研究致癌剂生物转化的活化系统。

传统的大鼠肝S9诱导剂为多氯联苯，但因其是致癌剂，严重污染环境，现许多国家已禁止生产。本发明通过多种诱导剂联合诱导的方法制备大鼠肝S9，获得具有高酶活性的大鼠肝S9。

发明内容

本发明的目的是建立一种可以获得高产量的肝S9以及较高的P450酶含量的大鼠肝S9制备方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法制备大鼠肝S9：大鼠肝S9的诱导及制备方法的步骤包括：(a)诱导剂以灌喂和腹腔注射的方式诱导SD大鼠；(b)断头处死大鼠，无菌条件下，清洗液冲洗肝中残血，取出肝脏；(c)按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的储存液重悬后再次低速离心取上清，合并上清经冷冻高速离心后收集上清，即肝S9；(e)检测依赖肝S9的诱变剂环磷酰胺对哺乳动物细胞的致畸变作用；本发明提供的大鼠肝S9制备方法显著提高了肝S9的酶活性。

可选的诱导剂为苯巴比妥钠、β-奈黄酮和地塞米松。

可选的诱导方法为大鼠连续3d腹腔注射剂量为80mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为80mg/kg地塞米松和80mg/kg的β-萘黄酮，第4d注射剂量为40mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为40mg/kg地塞米松和40mg/kg的β-萘黄酮。

可选的除去肝中残血的方法是将预冷的清洗液经肝门静脉灌洗除去残血，清洗液为含1.15％KCl和20％肝素(1500U/mL)，pH为7.4的10mM PBS。

可选的肝湿重比的比例为1∶2-1∶4。

可选的储存缓冲液为0.15M KCl(pH 7.4)。

可选的加入预冷的储存缓冲液的量是沉淀重量的1-2倍。

本发明提供了一种多诱导剂联合诱导制备大鼠肝S9的方法，大大提高了肝S9的酶活性。

附图说明

图1：CA实验检测大鼠肝S9对染色体畸变的影响

图2：环磷酰胺作用后的CHL细胞(a.正常、b.双着丝粒、c.交联、d.断裂)

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择体重为230±20g的SD雄性大鼠制备肝S9。具体操作如下：