[发明专利]一种阳离子脂质体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种阳离子脂质体及其制备方法与应用，属于基因治疗技术领域。

背景技术

随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗为遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病防治提供了一种极富前景的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。因此，研制安全高效的非病毒基因载体是目前基因治疗中亟待解决的问题。

阳离子脂质体是基因治疗常用的非病毒载体，其携带的基因转染无插入突变的危险，可携带大片段DNA，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、可容纳亲水性和疏水性物质、外源基因不易被降解等优点，因此，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。

但是，阳离子脂质体载体材料的脂质组成成分、组成比例以及制备的工艺过程，都会影响到其作为基因载体时的转染效率，从而直接影响到其能否有效保护所携带的外源基因并完成穿膜-入核-表达这一完整的基因治疗过程。虽然国内外研究人员设计开发了多种阳离子脂质体载体材料，并将之应用于细胞转染中，但由于这些载体材料自身存在的不稳定性、转染效率低等特点，真正能广泛应用于临床的阳离子脂质体基因载体材料仍然很少。因此，构建安全高效的阳离子脂质体基因载体材料，实现其在基因治疗过程中的基因有效传递，对基因治疗手段的开发具有关键的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供一种阳离子脂质体及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供该阳离子脂质体在制备阳离子脂质体核酸类药物制剂中的用途。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种阳离子脂质体，所述阳离子脂质体是由双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比(1-5)：(1-2)：(0.5-1.5)制备而成。

优选的，所述阳离子脂质体是由双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比3：1：0.5制备而成。

本发明的第二方面，提供上述阳离子脂质体的制备方法，步骤如下：

(1)将DODAB、DPPC和DOPE分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得混合溶液；

(2)在通入氮气的条件下将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥，将干燥后的薄膜用蒸馏水洗膜，将得到的水化液进行第一次超声处理，得到脂质分散液；将脂质分散液冻融，冻融后进行第二次超声处理，即得阳离子脂质体。

步骤(1)中，所述氯仿和甲醇混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为1:1。

步骤(2)中，所述第一次超声处理的时间为20～40min，进一步优选的为25～35min，最优选的为30min。

优选的，所述第二次超声处理时间为10～20min，进一步优选的为15min。

步骤(2)中，将得到的脂质体溶液进行反复冻融四次。实验发现，经4次重复冻融后，脂质体的粒径分布更加均匀，但是当冻融次数增加到5次，脂质体粒径变化很小。综合考虑处理效果和处理成本，选择冻融的次数为四次。

本发明的第三方面，提供一种核酸类药物制剂，所述核酸类药物制剂包含上述的阳离子脂质体和待转染的核酸。

所述核酸为DNA、RNA、siRNA或质粒中的任一种。

所述阳离子脂质体和核酸的N/P为(4-12):1；优选为8：1。

本发明的第四方面，提供上述核酸类药物制剂的制备方法，步骤如下：

(1)按上述方法制备阳离子脂质体；

(2)将阳离子脂质体在磷酸盐缓冲液或生理盐水中预平衡；预平衡后再加入待转染的核酸进行复合，即得核酸类药物制剂。