[发明专利]新的赖氨酸脱羧酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白以及包含该蛋白编码基因的表达载体和能够表达该蛋白的基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。

背景技术

1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺和尸毒素，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的，反应为L-lysine+H⁺→CO₂+cadaverine。

1,5-戊二胺具有多种用途。例如，在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量。在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是一种重要的药物中间体。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料；将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙。

尼龙66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，与尼龙6同为尼龙两大品种之一。目前，己二胺的合成仍然依赖于石油化工路线，己二胺及其前体己二腈主要依赖进口。随着石油资源逐渐枯竭，石油资源消耗带来的温室效应、环境污染等问题日益突出，绿色可持续发展的呼声不断升高，人们试图寻找一种用生物路线生产己二胺或其替代物、最终用可再生资源替代石油原料来生产尼龙的新方法。

1,5-戊二胺与己二胺互为同系物，在结构上与己二胺非常相似，可以和二元酸共聚合成具有实用性的尼龙5X(尼龙54、尼龙56、尼龙510等)。例如，尼龙56是一种新型尼龙，与尼龙66一样具有良好的机械强度、较高的熔点和耐各种溶剂的特性，可以替代尼龙66使用，而且尼龙56触感宜人，如棉一样吸湿透气，显示出开发高舒适性服装的前景。尼龙54和尼龙510等其它以1,5-戊二胺为单体制成的尼龙产品则具有特殊的材料性能，具有潜在的应用价值。非常可喜的是，1,5-戊二胺可以用可再生生物质为原料，通过生物合成路线进行合成。

赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺生物合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种微生物中。目前，已经分别从大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。

目前，主要是来源于大肠杆菌的两种赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC用于1,5-戊二胺的生产或研究。日本味之素公司的US7189543专利以二羧酸调节pH并通过细胞过表达大肠杆菌的CadA酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，最高产量达69g/L；上海凯赛在其专利CN102851307A和CN201410004636.3中改造了蜂房哈夫尼菌，过量表达大肠杆菌CadA酶来催化赖氨酸生产1,5-戊二胺，催化温度为50℃，赖氨酸盐酸盐浓度为450g/kg，并调节赖氨酸底物初始pH为6.0，菌体用量为42.75g/L(细胞干重)，催化48h产生251g/kg的1,5-戊二胺。Young Hoon等人采用E.coli XL1-Blue工程菌过表达ldcC，控制初始菌体OD₆₀₀＝50，赖氨酸初始浓度为200g/L，并调节赖氨酸底物初始pH为6.8，催化温度为37℃，经过120小时催化后最终获得133.75g/L的戊二胺(Oh YH et al 2015)。现有的大肠杆菌的两个酶均有不足之处。CadA的最适pH约为5.5，当pH高于6.5活性快速下降，当pH提高到8.0时，它的活力几乎完全丧失(Lemonnier and Lane 1998)。由于1,5-戊二胺是较强的碱性物质，在赖氨酸脱羧转变为1,5-戊二胺时pH会升高，要维持赖氨酸脱羧酶的催化活力，需要加入大量的酸进行中和，这会导致成本的增加并最终产生无机盐废弃物。同时受反应器混合特性制约或受细胞内外环境的非均一特性影响，反应效率会由于局部pH过高而下降。如果使用具有高pH耐受特性的赖氨酸脱羧酶，1,5-戊二胺的生物合成路线将会效率更高，更加环保，更加有成本竞争力。另一方面，虽然LdcC的最适pH相对较高，约为7.6，并在pH6-8之间都具有较高活性，但它的热稳定性很差，当温度超过37℃时，随着温度升高酶活性快速下降(Lemonnier and Lane 1998)。由于酶的稳定性与酶的用量、工艺成本直接相关，因而LdcC也不是一个理想的1,5-戊二胺生产用酶。