[发明专利]循环肿瘤细胞样本保存液及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种循环肿瘤细胞样本保存液，主要用于保存含有循环肿瘤细胞的样本，属于体外诊断技术领域。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。

恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞(CTCs)，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶；因此早期发现血液中的CTCs，对于肿瘤患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。但是，CTCs在外周血中的数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/10⁶~1/10⁷，并且它是连续产生的，在血液中呈动态分布，会出现滞后现象，具有很强的异质性，因此CTCs的检测一直受到挑战。在目前，针对上皮源性肿瘤的循环肿瘤细胞的研究甚少，因此将循环肿瘤细胞作为一种实时上皮源性肿瘤的“液体活检”的手段，即减缓了肿瘤患者组织活检的生理及心理的痛苦，又可以辅助临床医生进行患者总生存期和无进展生存期的评估、临床放化疗的疗效监测、肿瘤转移复发预测以及早期预警等，进而具有指导个体化医疗、改善肿瘤患者的生存状态的重要临床意义。

临床工作中，血液检测在很多情况下不是即时的，甚至需要通过长途运输，致使血液检测的准确性与使用的保存液有关，改良保存液是提高血液检测准确率的必要条件。癌症患者外周血液中的CTCs计数对于癌症预后和治疗监测具有重要意义，而患者外周血液中的CTCs数目非常少，CTCs又具有较强的脆性，这使得含有CTCs细胞的全血样本在运输过程中非常不稳定。同时，CTCs的检测更是要求能保持CTCs表面和细胞内部抗原活性，这就需要寻找一种新的保存液来满足这一特殊要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞样本保存液，能很好地保护样本中的CTCs细胞形态，并能使CTCs细胞数量保持稳定。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该循环肿瘤细胞样本保存液其特征在于：所述保存液的组分包括多聚蔗糖、泛影葡胺钠、多聚甲醛、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液。多聚蔗糖和泛影葡胺钠常组合作为血细胞的密度梯度离心液，在本发明中用于保护单核细胞层中的细胞，包括CTCs；多聚甲醛常用于固定细胞，在本发明中用于保护CTCs表面和内部抗原，保持其活性；牛血清白蛋白常用于细胞培养、生化测定、抗体稀释等，在本发明中为CTCs和其他细胞提供一个储存环境；加入防腐剂主要是为了延长循环肿瘤细胞样本保存液的有效期；缓冲液是为所有组分提供一个稳定的环境。

本发明优选所述的防腐剂为叠氮钠，叠氮钠的优选浓度为1g/L。叠氮钠是一种常用的防腐剂，在实际应用中也可替换为其他防腐剂，例如ProClin-300。

本发明优选所述的缓冲液为1×PBS溶液，1×PBS溶液的pH值为7.2-7.4。PBS溶液有多种配方，在pH值合适、细胞不产生形变或破裂的情况下，均适用于本发明。另外，在pH值合适、细胞不产生形变或破裂的情况下，其他类型的缓冲液也可应用于本发明，例如Tris缓冲液。

本发明优选所述多聚蔗糖的浓度为57g/L，所述泛影葡胺钠的浓度为90 g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为50 g/L；所述多聚甲醛的浓度为3.2g/L。多聚甲醛不易溶解，因此本发明中所采用的是配置好的8%多聚甲醛水溶液作为配制原料，使用量为40ml/L；所述8%多聚甲醛水溶液中多聚甲醛的浓度为80g/L。

本发明所述循环肿瘤细胞样本保存液配置方法包括如下步骤：

a.称取57g多聚蔗糖、90 g泛影葡胺钠、50 g牛血清白蛋白和1g叠氮钠，逐一加入1×PBS溶液中溶解，过程中注意一个组分溶解后再加入下一个组分；

b.量取40ml 8%多聚甲醛水溶液，加入上述溶液中并混匀；

c.用1×PBS溶液定容到1L，混匀，即得循环肿瘤细胞样本保存液。

本发明还提供一种所述循环肿瘤细胞样本保存液的应用，其特征在于：所述保存液的使用方法至少包括以下步骤：

a.样本采集；

b.样本稀释；

c.样本密度梯度离心；

d.移出样本的单核细胞层部分，并对单核细胞层部分进行清洗；

e.离心并去除上层清洗液；