[发明专利]一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法

说明书

本发明提供了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，具体的本发明通过高密度发酵破壁离心后的上清作为粗酶液，将粗酶液中的乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶经戊二醛交联制备共交联酶聚集体，而且通过添加吐温80将共交联酶聚集体的酶活回收率提高到82％。

技术领域

本发明涉及一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备以及该酶聚集体的稳定性和重复使用率的研究，属于酶固定化技术领域。

背景技术

2011年8月3日，美国食品药品监督管理局批准由辉瑞公司生产的克唑替尼用于治疗ALK基因重排的NSCLC。2016年3月11日，又被批准用于治疗ROS1基因突变的NSCLC，其市场需求不断增加。在其合成过程中，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是关键的手性中间体。现多通过化学法合成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，但不容易得到高纯度的手性化合物，且合成过程复杂，生物合成可以克服这些弊端。

现有的最新的生物合成技术是通过乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达菌株的发酵液，通过乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶与NADP和NADPH的辅酶循环再生体系来催化1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酮合成手性中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)如参考文献(刘丽勤,张骏梁,谭俊,等.乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇[J].工业微生物,2016,46(3):8-12.)。

交联酶聚集体是一种新型的酶固定化技术，能实现酶的聚集和固定化，便于回收利用，而且不需要载体，制备成本低。因此，为了有效地提高手性化合物的制备效率，降低制备成本，本领域技术人员致力于开发催化1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酮合成手性中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)酶固定化技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，所述方法中包括步骤：

在表面活性剂存在的条件下，经交联剂进行乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的共交联反应。

在另一优选例中，所述表面活性剂选自下组：吐温80、和吐温60。

在另一优选例中，所述方法中，进行所述共交联反应的交联反应体系内表面活性剂和底物酶(乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)的质量比为0.1～1.2：0.5～1；优选地质量比为0.2～1：0.5～1；最优选为约0.4～0.8：1。

在另一优选例中，定义所述底物酶为乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶之和。

在另一优选例中，所述交联反应中使用戊二醛作为交联剂。

在另一优选例中，所述交联反应体系内戊二醛和底物酶(乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)的质量比为0.1～1.2：0.5～1；优选为0.2～1.2：1；最优选为约1：1。

在另一优选例中，交联反应中表面活性剂：交联剂：底物酶(乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)的质量比为0.4-0.8：0.8-1.2：0.8-1.2。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)提供含有乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合物；

(2)交联反应

制备交联反应体系，所述交联反应体系中包括：步骤(1)提供的含有乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合物、交联剂和表面活性剂，0℃～40℃条件下进行交联反应，从而制得所述乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，包括步骤：

在基因工程菌中共表达乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，从而获得所述含有乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合物。