[发明专利]耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株、在合成苯基乳酸中的应用及其合成方法

权利要求书

1.耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株Escherichia coli Z2016，其特征在于：该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M 2016332。

2.权利要求1所述的耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株中导入质粒pET-28a-ldh^Y52V、pET-28a-ldhL后形成的重组突变菌E.coli Z2016 pET-28a-ldh^Y52V、E.coli Z2016 pET-28a-ldhL在合成苯基乳酸中的应用。

3.一种利用耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株合成苯基乳酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）感受态细胞的制备

1）挑取活化后的权利要求1所述的大肠杆菌突变株Escherichia coli Z2016在LB液体培养基中37℃、200 rpm过夜培养；

2）按照1%接种活化菌液于BT培养基中，于16℃、250 rpm培养至菌液OD₆₀₀=0.6；

3）将培养菌液转移到灭菌预冷的聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10 min后于4℃、4000rpm离心5 min；

4）弃上清液，每50 mL培养物菌体沉淀用5 mL 冰上预冷的BT Buffer F充分重悬菌体，冰上放置15 min；

5）于4℃、4000 rpm离心5 min收集菌体，用2 mL冰上预冷的BT Buffer E充分重悬菌体，按每管100 µL分装到冰上预冷的1.5 mL离心管中，制备好的感受态用于转化或-86℃冰箱中保存；

（2）质粒pET-28a-ldh^Y52V、pET-28a-ldhL转化感受态细胞

1）将10 µL质粒连接液加入至100 µL感受态细胞中，轻弹混匀充分，冰浴30 min-40min；

2）将离心管置于42℃金属浴中热激60-90 s后，将离心管取出后立即放置冰上2 min-3min；

3）加入预热好的37℃的LB液体培养基890 µL，37℃振荡培养60 min；

4）将转化液4000 rmp离心2 min，吸出750 μL上清液；

5）在提前配置好的含有卡那霉素的LB平板培养基中加入20 μL的IPTG，使用无菌的涂布棒将其均匀的涂开；

6）将剩下的菌液轻轻混匀后均匀涂布到转化平板上，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时；

7）挑取单菌落利用菌落PCR、酶切方法筛选出符合要求的阳性克隆，进行DNA测序验证；

（3）重组突变菌株全细胞合成PLA

将活化的重组突变菌按1%的接种量接种到含50 µg/mL 卡那霉素的100 mL LB液体培养基的摇瓶中，37℃、200 rpm 恒温振荡培养至OD₆₀₀为0.6−0.8，加入终浓度1.0 mmol/LIPTG 25℃诱导培养8 h后，4℃、6000 rpm 离心10 min收集菌体，菌体用pH 7.0 磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于100 mL缓冲液，含有2%葡萄糖和12 g/L底物，定时取样进行HPLC检测，当PPA消耗后补加6 mL 200 g/L PPA，反应120 min。