[发明专利]一种生产子囊霉素FK520的基因工程菌及其制备方法

说明书

本发明公开了一种生产子囊霉素FK520的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在天然生产FK520的吸水链霉菌的基因组中整合有VGB基因的工程菌。通过发酵实验验证，利用该工程菌制备子囊霉素FK520，所得FK520的发酵单位较利用天然产FK520的吸水链霉菌发酵所得FK520的发酵单位提高了1.38倍。

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种生产子囊霉素FK520的基因工程菌及其制备方法。

背景技术

子囊霉素FK520是含23元环的大环内酯类化合物，具有免疫抑制和抗真菌活性，其分子式为C₄₃H₆₇NO₁₂，分子量为789.99，易溶于甲醇、丙酮等。FK520是他克莫司(Tacrolimus,FK506)的乙基类似物，能够抑制T细胞的活性及相关炎症因子的合成，其衍生物“匹美莫司”，已成为一种重要的免疫抑制药物。

目前，FK520主要还是通过吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵的方法进行大规模生产，但是在实际的生产过程中，其发酵过程难以控制，菌体生长过快、过稠、过密，氧气利用下降严重制约次生代谢产物FK520的积累。控制FK520发酵过程成为一个生产难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的吸水链霉菌在发酵过程中氧气受限的不足，提供一种能够在FK520发酵过程中高效利用氧气的吸水链霉菌及相应的基因、重组载体、转化子和制备子囊霉素FK520的方法，可改善吸水链霉菌发酵过程的溶氧，促进菌体呼吸作用效果，提高所得FK520的发酵单位。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种生产子囊霉素FK520的基因工程菌，其是天然生产FK520的吸水链霉菌的基因组中整合有血红蛋白基因(Vitreoscillahemoglobin gene,VGB)的工程菌。其中，所述VGB基因可以是天然的外源VGB基因，也可以是针对天然产子囊霉素FK520的吸水链霉菌做过密码子优化的VGB基因。较佳地，所述VGB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种VGB基因，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种VGB全序列基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。该VGB全序列基因包括ermE*启动子和VGB基因。

本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种包含本发明所述VGB基因的重组载体。其中，所述重组载体的骨架为本领域常规的载体。较佳地，所述重组载体的骨架为质粒pSET-152。较佳地，所述质粒pSET-152的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。其可通过本领域常规的方法将本发明的VGB基因的核苷酸序列连接于载体。较佳地为，将双酶切后获得的具有粘性末端的目的VGB全序列基因片段插入到pSET-152载体的多克隆位点上，经连接酶连接，形成含有本发明的VGB基因的重组载体pSET-VGB。

本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种包含本发明所述的重组载体的转化子。其中，该转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)ET12567，将前述重组载体pSET-VGB转化至大肠杆菌ET12567即可获得转化子。

本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：一种制备所述生产子囊霉素FK520的基因工程菌的方法，包括将所述转化子与天然产FK520的吸水链霉菌接合，挑选接合子即得。其中，所述天然产FK520的吸水链霉菌为常规的天然产FK520的吸水链霉菌，较佳地为吸水链霉菌ATCC 14891。所述的转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主，优选宿主为大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。转化子中含有的重组载体的骨架优选质粒pSET-152。