[发明专利]基于微流控芯片的模拟药物体内代谢过程的肝-肾体系

权利要求书

1.一种模拟药物肝代谢对肾脏影响的肝-肾体系微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过PDMS与底层芯片的上表面粘合封接；

顶层芯片由U形的顶层芯片主通道(1)和顶层芯片主通道入口(11)连接而成；

底层芯片由左侧主通道(3)、右侧主通道(6)、胶原通道(7)、胶原通道入口(8)、底层芯片左侧主通道入口(9)以及底层芯片右侧主通道入口(10)组成，胶原通道(7)左连左侧主通道(3)，右连右侧主通道(6)；所述底层芯片的左侧主通道(3)为I形，所述底层芯片的右侧主通道(6)为U型，所述底层芯片细胞胶原通道(7)为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧主通道(3)和右侧主通道(6)相连接，横向结构的数量为1～10个；胶原通道(7)与左侧主通道(3)的交界为半球形界面(12)，胶原侧为凹面；

顶层芯片主通道(1)通过多孔滤膜(5)下连底层芯片左侧主通道(3)；底层芯片左侧主通道(3)通过多孔滤膜(5)上连顶层芯片主通道(1)，右连胶原通道(7)；

所述底层芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道(3)、右侧主通道(6)高度为200-500μm，胶原通道(7)高度为80-200μm。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述芯片材料为可透光透气的PDMS聚合物，PDMS单体与引发剂比例为5～10:1，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01～10um。

3.一种基于微流控芯片的模拟药物体内代谢过程的肝-肾体系，其特征在于：采用权利要求1所述的微流控芯片，按照以下方法构建而成：

(1)芯片预处理

设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，加1mL PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，细胞主通道加入新鲜的细胞培养液；

(2)细胞的接种与培养

肝细胞调整至1～5×10⁶cells/mL的细胞悬液，加入顶层芯片主通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养，每隔24h换液一次；

提取原代大鼠肾小球微组织，调整至10⁴～10⁵cells/mL的细胞悬液，取10μL细胞悬液加入左侧主通道，左侧主通道向上，胶原通道向下侧立培养过夜，使细胞贴附在底层芯片左侧主通道与胶原通道的半球形界面，在光学显微镜下观察可见肾小球微组织贴附于胶原界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次；

(3)待细胞生长状态良好，可进行后续试验；观察药物经代谢后对肾小球功能的影响及其他。

4.按照权利要求3所述一种基于微流控芯片的模拟药物体内代谢过程的肝-肾体系应用，其特征在于：可采用权利要求3所述体系，对药物毒性进行评价，具体过程如下：

(1)使用CCK-8试剂盒进行细胞活性的检测，CCK-8试剂：细胞培养基的体积比为1:9，混合均匀成检测工作液，加入底层芯片左侧主通道，置培养箱中3小时后，转入96孔板中，酶标仪测定450nm处吸光度，用于对细胞活力进行定量，作为药物毒性的指标之一；

(2)乳酸脱氢酶(LDH)漏出，收集芯片通道内细胞培养液，使用LDH试剂盒，操作检测培养液LDH漏出浓度，用于观察药物对细胞的损伤程度，作为药物毒性的指标之一；

(3)免疫荧光，常规免疫染色操作，荧光显微镜观察拍照，进行Live/Dead染色，观察死活细胞数；ZO-1染色，观察细胞紧密连接情况；F-actin染色，观察细胞骨架蛋白等作为药物毒性的指标；

(4)蛋白滤过，使用白蛋白，加入左侧主通道，1小时后，收集右侧主通道培养液，白蛋白试剂盒操作检测蛋白浓度，观察中分子量白蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标；

(5)蛋白滤过，使用IgG，加入左侧主通道，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60min拍照，分析IgG渗透性，观察高分子量蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标。