[发明专利]一种用于羊新疆巴贝斯虫病检测的间接ELISA方法

说明书

本发明公开一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，包含大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP‑1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原。

技术领域

本发明涉及一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，具体涉及大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原，而建立起的一种间接ELISA方法。

背景技术

羊巴贝斯虫病(ovine Babesiosis)是由媒介蜱传播的由巴贝斯科巴贝斯属的以绵羊巴贝斯虫(Babesia ovis)，莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和粗糙巴贝斯虫(B.crassa)为主要病原因子寄生于绵羊和山羊的红细胞内所引起的疾病的总称。是主要分布在热带和亚热带地区的血液原虫病。临床反应通常以高热，溶血性贫血，黄疸，血红蛋白尿为主要特征，严重时引起死亡。本病危害严重，严重时可引起死亡，给养羊业造成重大经济损失。

羊巴贝斯虫在宿主红细胞内进行无性繁殖，有性繁殖发生在传播媒介蜱体内，并通过蜱的叮咬传播到宿主体内，因此巴贝斯虫的分布与其传播媒介-蜱的分布范围相一致。在我国主要感染绵羊和山羊的巴贝斯虫有莫氏巴贝斯虫和新疆巴贝斯虫未定种。阻断裂殖子对红细胞的入侵过程是控制巴贝斯虫感染的关键；裂殖子的表面蛋白或由裂殖子细胞器所分泌的、在入侵过程中发挥作用的蛋白可能作为抗原蛋白或药物靶点，阻断裂殖子入侵宿主红细胞进行无性繁殖被认为是一种具有潜力的防治策略。棒状体相关蛋白(Rhoptry-associated protein 1,RAP-1)位于顶复门寄生虫裂殖子的棒状体上，是寄生虫与宿主红细胞粘附后由棒状体分泌的与红细胞入侵相关的蛋白。

目前常用的分子诊断方法有PCR、RLB、RPA等。虫体宿主体内产生抗体，且抗体可持续存在较长时间，因此血清学诊断是较为实用经济的方法用于巴贝斯虫病的诊断。

目前，重组抗原(裂殖子抗原，棒状体相关蛋白和致密颗粒蛋白)已被广泛地用于牛、马和犬巴贝斯虫病的血清学检测。

对于羊巴贝斯虫病检测,通过牛巴贝斯虫粗抗原和合成的牛巴贝斯虫抗原(11C5)建立的ELISA方法可用于检测绵羊巴贝斯虫感染后产生的抗体(参见Duzgun,A.,Wright,I.G.,Waltisbuhl,D.J.,Gale,K.R.,Goodger,B.V.,Dargie,J.D.,Alabay,M.,Cerci,H.(1991).An ELISA for the diagnosis of Babesia ovis infection utilizing asynthetic,Babesia bovis-derived antigen.Veterinary Parasitology 39,225-231),目前，有些新的重组蛋白被认为可作为候选诊断抗原：绵羊巴贝斯虫分泌抗原1和分泌抗原2用于绵羊巴贝斯虫病的检测,以及BQP35和热休克蛋白90用于中国流行的莫氏巴贝斯虫抗体的检测。基于重组蛋白BQP35通过免疫印迹和ELISA方检测显示莫氏巴贝斯虫的临潭和天祝株有交叉反应,而热休克蛋白90产生非特异性反应。目前为止，2012年关贵全利用裂殖子粗抗原建立了间接ELISA方法用于检测新疆巴贝斯虫未定种，但与牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫有交叉反应。

本发明利用获得棒状体相关蛋白(RAP-1)序列，克隆表达获得RAP-1重组蛋白，经动物免疫、Western Blotting和ELISA实验证实，RAP-1重组蛋白均具有较好的免疫原性和反应原性，且特异性好。用RAP-1重组蛋白建立的间接ELISA方法，完全适用于我国羊新疆巴贝斯虫病的血清学检测和流行病学调查。

本发明利用中国羊巴贝斯虫病的流行虫种-新疆巴贝斯虫未定种的rap-1基因，通过克隆表达，以纯化的RAP-1蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出新疆巴贝斯虫未定种RAP-1抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低。本发明针对我国畜牧业领域中羊新疆巴贝斯虫病的发病状况确定了判定标准，从而能够有效检测新疆巴贝斯虫感染的绵羊和山羊。

发明内容