[发明专利]一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于色谱柱的制备领域，具体涉及一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法及其应用。

背景技术

整体柱的制备采用了原位聚合的方式，这样避免了填充柱繁琐的得颗粒装填和烧制柱塞等步骤，并且具有更高的柱容量，因此近年来受到广泛关注。整体柱由于其独特的孔状结构，比常规的填充柱通透性更好，可实现快速分离，根据其基质原料的不同，整体柱可分为硅胶整体柱、有机聚合整体柱、有机-硅胶杂化整体柱。硅胶整体柱的优点是机械强度好，耐高温耐有机溶剂；缺点是制备周期长，容易发生开裂和弯曲变形等情况，并且耐酸碱腐蚀性差。有机聚合整体柱具有制备过程简单，PH应用范围广，生物相容性好，其通透性及孔径可以通过改变致孔剂的比例来调节以及其选材的广泛性等优点；缺点是在某些有机溶剂中容易发生溶胀、稳定性差。为了结合两者的优点，有机-硅胶杂化整体柱越来越受到关注，Hayes等首次采用溶胶凝胶法制备了有机-硅胶杂化整体柱，以N-十八烷基二甲基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为有机单体，以四甲氧基硅烷为交联剂，在酸催化下试剂中的甲氧基硅基水解产生硅羟基，后经硅羟基的缩聚反应形成有机-硅胶杂化整体柱(Hayes J.D., Malik A., Anal. Chem. ,2000, 72(17), 4090-4099)。其制备方法主要有溶胶凝胶法、“一锅法”和其它聚合方法。琼脂糖由于具有亲水性，并且对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体，通常用琼脂糖凝胶分离生物蛋白分子，目前为止将琼脂糖与硅胶通过缩水反应键合制备的有机-硅胶杂化整体柱未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法，该方法具有操作简单、制备出的整体柱方便表面修饰的优点，解决了以琼脂糖凝胶作为载体的免疫亲和柱不易保存、易发生溶胀等缺陷，制备得到的整体柱兼具有机械强度好、亲水性和重现性好等优点，对生物分子的富集具有高选择性和高富集倍数。

本发明所采用的技术方案是：一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法，该整体柱采用溶胶凝胶的方法将四甲氧基硅烷、琼脂糖、聚乙二醇、尿素在冰浴条件下混合制得预聚合体系，接着将预聚合体系装入石英毛细管中制备出亲和整体柱，最后对亲和整体柱进行三步修饰，制得表面含有酰胺基团的琼脂糖键合硅胶杂化整体柱。

所述琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法，具体包括以下步骤：取尿素、聚乙二醇加入到离心管中，同时加入经过氧化的琼脂糖，在冰浴条件下搅拌均匀，然后滴入浓氨水，搅拌后加入四甲氧基硅烷，搅匀、超声处理后制得预聚合体系，接着将预聚合体系注入石英毛细管中，密封，加热反应，得到亲和整体柱，再对亲和整体柱进行三步修饰，制备得到含有酰胺基团的琼脂糖键合硅胶杂化整体柱。

作为本发明一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法的进一步优化，所述琼脂糖的氧化过程为：在浓度为3mol/L硝酸溶液、反应温度为70℃以及光照条件下反应6h。

作为本发明一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法的进一步优化，氧化琼脂糖与四甲氧基硅烷加入量的体积比为3:1，且浓氨水的滴加量为：每3ml氧化琼脂糖滴加0.8-1.5ml浓氨水。

作为本发明一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法的进一步优化，反应中超声处理的时间为2min。

作为本发明一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法的进一步优化，所述加热反应的具体过程为：毛细管两端封口，40℃陈化20h，然后从40℃升温至90℃，在90℃温度下反应7h。

作为本发明一种琼脂糖键合硅胶杂化整体柱的制备方法的进一步优化，所述的三步修饰为在制备好的亲和整体柱上分别用烯丙基缩水甘油醚、巯基乙酸和N-羟基琥珀酰亚胺进行修饰，最终得到含有酰胺基团的琼脂糖键合硅胶杂化整体柱。

所述的琼脂糖键合硅胶杂化整体柱可以用于分离富集莱克多巴胺生物分子。

与现有技术相比，本发明至少具有下述优点及有益效果：

本发明把具有亲水性的琼脂糖与硅胶通过缩聚反应聚合到一起制备出琼脂糖-硅胶杂化整体柱，该整体柱兼具有机械强度好、骨架结构稳定、通透性良好、质地均匀、亲水性和重现性好等优点，对生物分子的富集具有高选择性和高富集倍数。以该杂化整体柱为载体可以通过化学反应在表面修饰上酰胺基团，利用酰胺基团可以分离富集一些生物分子，亦可以将该杂化整体柱作为载体制备免疫亲和柱。