[发明专利]免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法

说明书

本发明公开了一种免疫亲和柱净化‑超高效液相色谱‑串联质谱检测鱼虾中3‑甲基‑喹噁啉‑2‑羧酸的方法，匀质好的样品经2mol/L HCl溶液酸解后，将提取液pH调节至7～8，经过免疫亲和柱富集和净化后，采用LC‑MS/MS测定，外标法定量。以0.1％甲酸水溶液‑甲醇为流动相，梯度洗脱分离，电喷雾正离子多反应监测模式监测。本发明重现性好，灵敏度高，适合水产品中MQCA的实际测定。

技术领域

本发明涉及一种3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的检测方法，特别涉及免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法。

背景技术

3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹噁林类药物喹乙醇的残留标示物，同时也是喹烯酮、乙酰甲喹的代谢产物。研究表明喹乙醇对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在致畸形，致突变，致癌作用。因此在世界范围内都被禁止或限制用作饲料添加剂。喹乙醇在体内代谢迅速，而MQCA在体内滞留时间长，含量与总残留关系稳定，是国际食品法典委员会认定的标示残留物之一，可作为残留分析监控的目标物质。

目前水产品中MQCA的检测主要采用高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法。液相色谱-串联质谱以其定性准确、灵敏度高等特点被广泛采用。为降低基质效应的影响，在前处理过程中，提取后的MQCA一般要再经过净化浓缩步骤，固相萃取是MQCA最常用的净化方式。根据MQCA的化学结构和性质，常采用HLB柱和阴离子交换柱净化样品。免疫亲和柱(IAC)以抗原和抗体反应为基础，具有特异性强、富集率高和净化效能好的优势，已成功应用于黄曲霉毒素、河豚毒素等物质的净化和富集中，而目前未见采用免疫亲和柱净化水产品中的MQCA的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，方法基质干扰低，特异性强，重现性、回收率均较好，操作简便，适合于实际样品的检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：称取匀质好的样品5g置于50mL具塞离心管中，加入10mL 2mol/LHCl溶液，涡旋振荡1～2min后置于气浴恒温振荡器中60℃恒温酸解30min，冷却至室温后，8000r/min离心5min，移取上清液至50mL离心管中，残渣中加入10mL 2mol/L HCl溶液重复提取一次，合并提取液并用水定容至25mL，混匀后用定量滤纸过滤，准确移取过滤后的提取液5mL用4.0mol/L NaOH溶液调pH至7～8，得样品液；

(2)免疫亲和柱净化：取出免疫亲和柱，待回至室温后去掉免疫亲和柱堵头，放出柱内保存液，上样品液，以1滴/2s的速度过免疫亲和柱，上样结束后,先后用4mL PBS溶液和4mL水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，弃去以上全部流出液，用4mL 2％的乙酸-甲醇溶液洗脱目标物，洗脱液于50℃水浴氮气吹干，加入1mL初始流动相溶解残渣得净化液；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的含量。

作为优选，步骤(2)中初始流动相为0.1％甲酸-甲醇溶液，0.1％甲酸溶液：甲醇溶液的体积比＝9:1。

作为优选，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱，规格：50mm×2.1mm，1.7μm；进样量10μL；样品室温度10℃，柱温40℃；流动相：A为0.1％甲酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序如下：0～3min,90％～10％A；3～4min,10％～90％A；4～5min，A保持90％不变；流速：0.3mL/min。