[发明专利]一种基于生物碱的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，是一种判别烟草代谢组学研究所用的新鲜烟叶样品质量是否满足代谢组学研究需要的判别方法。

背景技术

植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后期代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体的一种技术。在代谢组学轮廓分析的流程中，典型样品的采集是首要并且极其重要的步骤，获得合格样品，以真实客观的反映样品的代谢状态，是代谢组学分析进行的基础和前提。植物新鲜烟叶样品的采集，需要在低温下淬灭以停止其生理活动以保证其停止在采样时的代谢状态，标准做法为采摘植物样品后，锡纸包裹，置于-196℃液氮冷冻，用于新鲜烟叶分析或者冻干后用干粉样品分析。在样品采摘到分析前的这一段过程，需保证新鲜烟叶在液氮中保存且在液氮条件下研磨，否则会造成新鲜烟叶的酶促褐变。由于烟叶样品保存不当而导致的质量发生变化，代谢物水平不能反映烟叶样品真实状态的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟叶样品质量进行判别。

烟草生物碱作为烟草中一类最重要的化学成分之一，其组成和含量对烟叶的吃味、刺激性和香气都有直接的影响，其它糖、氮类物质和形成综合香气成分物质对烟草的质量处于辅助和从属地位，但各类物质与生物碱的比例和协调关系又在很大程度上左右烟草的质量。近年来有关烟草中生物碱的提取、检测等方法的报道层出不穷，但未曾有人提出将新鲜烟叶中的生物碱含量或含量比值用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于生物碱的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。本发明的方法利用新鲜烟叶中烟碱烯和4,4′-二联吡啶含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，该法操作简单快速，结果准确可靠。

本发明的目的可通过下述技术措施来实现：

本发明的基于生物碱的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法，其特征在于：通过检测新鲜烟叶中烟碱烯和4,4'-二联吡啶含量，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别；具体步骤如下：

a、称取新鲜烟叶冻干样品100~150mg，加入0.83~1.75mL5％氢氧化钠溶液，湿润试样，静置15min，加入10mL 0.01%的三乙胺的甲基叔丁基醚溶液和含内标的提取溶剂，加盖后置于摇床上室温振荡萃取1.5~2小时后离心，移取4~7mL上清液（有机相）并浓缩10倍，进GC/MS分析，采用保留时间和选择离子（SIM）模式定性，检测生物碱的含量；

b、GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f. )；程序升温：以8 ℃/min的速度从100 ℃升至260 ℃（10 min）；载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量 2 µL，分流进样，分流比 10:1；

c、GC/MS分析方法的质谱参数：溶剂延迟：8 min；电离电压：70 ev；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；扫描方式：选择离子模式（SIM），选择离子如下：2-甲基喹啉（IS）（143），烟碱（84），降烟碱（119），麦斯明（146），假木贼碱（84），烟碱烯（158），新烟碱 （160），2,3′-二联吡啶（156），4,4′-二联吡啶（156），可的宁（176），N-甲酰基降烟碱（176），烟碱-1-氧代（84），D8 -二联吡啶(IS)（164）。

本发明中所述内标为2-甲基喹啉和D8 -二联吡啶，其含量分别为180μg/mL和12μg/mL；所述的提取溶剂为含0.01%的三乙胺的甲基叔丁基醚溶液；所述新鲜烟叶与含内标的提取溶剂按质量（mg）/体积（mL）比为10~20:1。

本发明中所述新鲜烟叶冻干样品由大田采摘的新鲜烟叶，于-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低温冻干，-80℃冰箱保存待用的烟末。

本发明采用气相色谱串联质谱GC-MS对新鲜烟叶样品中烟碱烯及4,4′-二联吡啶进行绝对定量分析，计算比值以烟碱烯及4,4′-二联吡啶含量的比值为指标，建立区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，分析步骤如下：