[发明专利]用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

据报道，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。降低恶性肿瘤死亡率的主要途径是早期诊断和早期治疗。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清肿瘤标志物(tumor marker，TM)，由于TM的敏感性和特异性相对较高，较为经济，检查时痛苦少，且适合大批量标本检测，TM的临床应用受到了广泛的关注。

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径的一个关键酶，它有四种同工酶，分别为L型、R型、Ml型和M2型，它们的分布具有相对的组织特异性，通常均以酶的活性四聚体形式存在。目前研究表明，几乎所有不同组织来源的肿瘤均伴有丙酮酸激酶的异构重整体M2-PK的过度表达,故称为肿瘤型M2-PK(Tumor M2-PK，TU M2-PK)。在正常细胞中，M2-PK主要以三聚体的形式存在，而在肿瘤细胞中，M2-PK大量表达并转变为主要以二聚体的形式存在。三聚体的M2-PK与磷酸烯醇丙酮酸pep亲和力很高，而二聚体的M2-PK与pep的亲和力则低的多，后者因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞进行无氧糖酵解。TU M2-PK的升高可见于大多数癌症患者。尽管不同组织来源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其血中M2-PK的平均水平存在着一定的差别，但作为肿瘤标志物，M2-PK是很有应用价值的。尤其是肾癌，长期以来一直未发现较特异的肿瘤标志物,M2-PK很可能成为目前唯一可用于临床诊断肾癌的生化指标。早在1993年，在hamburg召开的(德国)第七界肿瘤标志物研讨会上，TU M2-PK就作为一种新的肿瘤标志物被提了出来。因此，监测血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TU M2-PK)可广泛应用于肿瘤的早期诊断、肿瘤预后判断以及评价肿瘤治疗疗效等方面。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种肿瘤型M2丙酮酸激酶(TU M2-PK)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TU M2-PK磁分离试剂，酶标记的TU M2-PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。.

所述TU M2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TU M2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。

所述酶标记的TU M2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TU M2-PK单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。

所述的标准品为不同浓度的TU M2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TU M2-PK标准品的50mmol/l PBS缓冲液，pH7.4。

洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。

所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

1)TU M2-PK磁分离试剂的制备：采用化学交联法将TU M2-PK单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用70mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵、0.1mg/ml的吐温20和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至8.0即得；

2)酶标记的TU M2-PK抗体溶液的制备：采用NaIO₄法标记TU M2-PK单克隆抗体，反应后透析纯化，然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解，加入终浓度0.5mg/ml酪蛋白，调pH值至8.0即得；

3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。