[发明专利]用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

肺癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤，其发病率以每年3％的速度上升。近年来对肺癌的治疗虽然取得很大进展，但效果仍不理想，其5年生存率仍在20％～30％，而中晚期癌治疗效果更差。研究表明，早期诊断率是提高生存率的关键所在，而目前所用标志物在敏感性、特异性方面还不能达到要求。

细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)是一分子量为40×10³的酸性蛋白质，是上皮细胞骨架的一部分，在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的障碍，使得大量细胞角蛋白片段释放入血，尤其是cyfra21-1在肺癌中含量丰富，其与CEA和NSE联合检测对肺癌的鉴别诊断，病情监测有重要价值。Cyfra21-1对乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌也是很好的辅助诊断和治疗监测指标。还应与其他有关的肿瘤标志物联合检测，以同时提高临床诊断的特异性和灵敏度。

对Cyfra21-1的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用I等放射性元素标记，检测设备复杂，必须用专门的仪器测定，其放射性核素的半衰期短，不能长期保存，同时也给实验操作人员带来了放射性伤害。ELISA检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点也不能满足临床的要求，因此，化学发光免疫分析方法(CLIA)应运而生。

磁性微球作为体外诊断的固相载体，起到识别、捕获、控制与运输目标待检分子的载体作用。由于其在整个反应过程中均是悬浮在待检样本中，与传统的多孔板载体相比，其整个反应基本处于液态或准液态状态，载体与待检物之间发生分子碰撞的几率大大增加。另外，由于磁性微球较大的表面积提高了负载目标待检分子的效率，因而使得其生物反应效率较传统多孔板方式大为提高；一般多孔板上的生物反应需要在1～3小时之间，而基于磁性微球的生物反应仅需十几分钟。另外，由于磁性微球卓越的超顺磁特性，使得采用全自动磁性分离方式与检测可以轻松地实现。

专利CN200710121167公开一种细胞角蛋白19片段的化学发光免疫分析方法，但是其仍然是将相关抗体固定在传统的多孔板上进行相关检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有Cyfra21-1磁分离试剂，酶标记的Cyfra21-1抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。

所述Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。

所述酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗Cyfra21-1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。

所述标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液，其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液，pH7.4。

洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。

所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备：采用化学交联法将Cyfra21-1单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用1％的BSA溶液封闭3小时，磁性分离微球，用PBS缓冲液冲洗三次，然后用50mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至7.4即得；