[发明专利]一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用

说明书

一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用，属于分子生物技术领域。该玉米纹枯病菌SSR标记包括了8组引物对，该标记的制备方法包括：1）提取玉米纹枯病菌的基因组DNA；2）利用限制性内切酶酶切总DNA，获得DNA片段；3）生物素标记的探针与目的片段杂交；4）利用磁珠对含有SSR序列的DNA片段进行富集；5）对含有SSR序列的DNA片段进行扩增并纯化；6）将DNA片段进行克隆测序；7）根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，用于扩增该位点的微卫星片段。本发明引物特异性高、扩增稳定、操作简便，周期短、成本低，同时，SSR标记自身具有共显性遗传、多态性丰富的优点，能够用于玉米纹枯病菌遗传多样性的分析。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用。

背景技术

微卫星DNA，又称简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是一种由2-6 个核苷酸为单位均匀分布于基因组中的重复序列，在各种生物体内广泛分布。微卫星具有多态性高、共显性遗传、数量丰富、高分辨率、基因组覆盖距离广和易于检测等优点，使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一。分离微卫星位点的方法有多种，例如数据库查询法、近缘物种筛选法、基因组文库筛选法、富集文库法以及EST-SSR 法等。由于磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA 的作用，且不需要较多的物种基因组信息，被广泛地运用于微卫星位点的筛选。

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦和水稻，是粮食、饲料、工业原料和出口商品的多用途作物。我国的玉米种植面积和总产量仅次于美国，居世界第二位。然而，玉米纹枯病是玉米产区广泛发生的一种土传性病害，严重影响玉米的产量，造成巨大的经济损失，其病原菌是立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn），该菌寄主范围十分广泛，能侵染水稻、玉米、大豆、小麦等43科263种植物，引起纹枯、立枯等病症。但是对于玉米纹枯病菌的遗传学研究较少，特别是DNA 分子水平的研究极为有限。在玉米纹枯病菌遗传多样性的研究基础一直比较薄弱，在公共数据库中能得到的序列信息比较有限。因此，建立高效、全面、稳定的SSR技术的应用对玉米纹枯病菌遗传多样性的揭示具有很好的补充意义。

为了研究玉米纹枯病菌的遗传多样性，申请人利用磁珠法富集分离了玉米纹枯病菌的SSR 序列，并从中开发了SSR 引物序列，利用开发的标记对玉米纹枯病菌进行了遗传多样性研究的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种玉米纹枯病菌SSR 标记的制备方法，该方法易行，所需设备简单，操作简便，在不需要了解测试样品较多的遗传背景信息的情况下，能够在短时间内高效富集和分离微卫星DNA，从而分析获得其特异的SSR引物序列。

本发明的另一个目的是在于提供SSR标记在分析玉米纹枯病菌遗传多样性中的应用，所得到的SSR 引物具有较高的针对性，同时由于SSR标记自身具有数量丰富，多等位基因和呈共显性遗传等优点，不仅能够用于玉米纹枯病菌遗传多样性和亲缘关系分析，还可以运用到玉米纹枯病菌遗传图谱的构建、目标基因的克隆等研究中。

所述的一种玉米纹枯病菌SSR标记，其特征在于包括引物对MA1、MA3、MA4、MA8、MA10、MA11、MA12和MA14，所述的引物对MA1包括引物MA1F和引物MA1R，所述的引物对MA3包括引物MA3F和引物MA3R，所述的引物对MA4包括引物MA4F和引物MA4R，所述的引物对MA8包括引物MA8F和引物MA8R，所述的引物对MA10包括引物MA10F和引物MA10R，所述的引物对MA11包括引物MA11F和引物MA11R，所述的引物对MA12包括引物MA12F和引物MA12R，所述的引物对MA14包括引物MA14F和引物MA12R，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，