[发明专利]一种心肌环的培养方法

说明书

本发明属于动物细胞培养技术领域，涉及一种心肌环的培养方法。步骤如下：心脏样品的预处理，制备心室肌样品组织小块；心室肌样品组织小块的消化和终止；收集终止消化后的上清液进行培养，制备初期心肌环细胞液；对初期心肌环细胞液进行细胞换液后，观察心肌环的动态生长。本发明体外分离培养心肌细胞时，发现了心肌环样结构，并初步命名为“心肌环”，对心肌环细胞组分、形成机制及其分化潜能进行详尽研究非常必要；阐明此结构对进一步研究心肌干细胞功能及其分子调节机制、丰富种子细胞来源、研发心肌再生的新途径等具有重要意义，为心脏干细胞的自我更新和分化调控提供理论依据，为临床治疗缺血性心脏病提供新的思路。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，涉及一种心肌环的培养方法。

背景技术

传统观念认为，心脏是终末分化器官，不能进行内源性修复。近年来，从心脏中分离出的c-kit⁺和sca-1⁺细胞，增殖迅速，能分化为心肌、平滑肌和内皮细胞，称为心脏干细胞。这些干细胞能够参与维持心肌稳态和病理修复。依据其表达细胞标志物等多种因素，分为纯化的心脏干细胞和混合心脏干细胞。纯化的心脏干细胞有c-kit⁺细胞、sca-1⁺细胞、CD117⁺细胞、Isl⁺细胞、侧群细胞即SP细胞等。混合心脏干细胞包括心肌球（cardiosphere,CSP）和心肌球源性干细胞（cardiosphere derived cells, CDCs）。心肌球是将心内膜活检获取的心脏组织块，培养14-28 d，通过酶消化法获取向外生长的细胞，并将这些细胞悬浮培养获得球样成簇的混合细胞团。心肌球可分为两层：中心是可增殖的原始细胞层，表达c-kit等干细胞标记，外层是间质细胞和分化细胞层，表达CD105、CD90及心肌细胞特异性蛋白cTnT、缝隙连接蛋白Cx43等。体外培养的CSP和CDCs均具有较强的向心肌细胞分化和血管再生的能力，并能产生多种血管生成因子和抗凋亡因子；体内实验表明，小鼠、大鼠和猪的心肌梗死模型中，CSP和CDCs移植均能发挥良好的治疗作用，包括降低梗死区域面积和心室重塑，增加有功能的心肌细胞和毛细血管密度，促进局部室壁运动，提高心室功能等。Cho等将CDCs再次经过体外成球培养形成次级心肌球，注入到小鼠心肌梗死模型后，发现次级心肌球较心肌球更能明显提高迁移能力，促进新生血管生成，改善心功能、缩小梗死面积，其机制还有待进一步阐明。

1978年，Schofield 提出造血干细胞龛(Hematopoietic stem cell niche)，用以描述造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)所处的微环境。早期的组织学与解剖学的研究已经发现HSCs的微环境是由骨髓基质细胞(成纤维细胞、成骨细胞、成脂肪细胞、内皮细胞、巨噬细胞等)和细胞外基质(I、Ⅲ、Ⅳ型胶原、蛋白聚糖、氨基聚糖、纤维结合蛋白、层粘连蛋白等)共同构成。近期研究表明造血干细胞龛可调控信号的协调整合，防止干细胞更新与分化的过度，维系着组织正常功能。分化过度、削弱自我更新，可致干细胞枯竭；而干细胞自我更新过度，则阻碍级别分化，扩增过快，甚至向肿瘤转化。自2003年发现心脏干细胞后，众多学者也开始关注心脏干细胞龛（cardiac stem cell niche），心脏干细胞在龛内成簇分布，可以表达c-kit，心肌转录因子Nkx2.5，α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomericactin，α-SCA），龛内还有平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞分布，但对其在心肌中的分布、龛中细胞组分及增龄和疾病时变化、调控心脏干细胞稳定和分化的分子机制，目前还不清楚。

发明内容

本发明发现了体外培养的心脏干细胞自发形成的一种新的微环境，为解决心脏干细胞体外调控机制的技术难题，公开了一种心肌环的培养方法。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

一种心肌环的培养方法，步骤如下：

（1）心脏样品的预处理，制备心室肌样品组织小块；