[发明专利]一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种地衣芽孢杆菌工程菌在造纸制浆过程中的应用， 所述地衣芽孢杆菌工程菌为将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；

所述地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：

（1）提取地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F₁和R₁进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；

所述的PCR引物序列如下：

F1: CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R1: AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT

（2）提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cm^r片段；

所述的PCR引物序列如下：

F₂: ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

R₂: CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

（3）将步骤（i）制得的celB1片段与步骤（ii）制得的Cm^r片段进行重叠PCR，制得celB1-Cm^r片段；

（4）将敲除载体用限制性内切酶BamH I酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌；

所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 20085。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下：

2×HiFi-PCR master 25μL

浓度10μmol/L的F1 2μL

浓度10μmol/L的R1 2μL

模板 2μL

ddH₂O 19μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下：

2×HiFi-PCR master 25μL

浓度10μmol/L的F1 2μL

浓度10μmol/L的R1 2μL

模板 2μL

ddH₂O 19μL。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。