[发明专利]一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用。本发明提供方法包括如下步骤：整个或分段扩增病毒基因组，表达载体线性化处理，基因组两端或各基因片段与表达载体两端分别设计有用于体外拼接的重叠序列；病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外拼接；拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。重组农杆菌用于接种，获得病毒的系统性侵染。本发明的创新点在于将病毒基因组与表达载体通过体外核酸拼接后，不转化大肠杆菌，而是转化农杆菌，获得在农杆菌中稳定的病毒侵染性克隆，避免了病毒在大肠杆菌中产生的毒性或不稳定现象，构建方法更为灵活和简便。

技术领域

本发明涉及病毒学和分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用。

背景技术

侵染性克隆是病毒学研究领域的基础研究工具。克隆后的病毒基因组易于分子操作，因此，侵染性克隆在研究病毒的基因功能、侵染机理、病毒-宿主互作等方面具有重要作用。并且，病毒的侵染性克隆也可用作基因表达或沉默的载体。

申请号201410706857.5(黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用)公开了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)的侵染性克隆的构建方法，该病毒侵染性克隆由CGMMV全序列融合到带35S启动子和核酶的载体pCB301-CH后，将重组载体pCB301-CH转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆导入导入到农杆菌菌株EHA105获得病毒侵染性克隆。

然而，上述专利及其类似技术方案在病毒侵染性克隆构建过程中存在的一个重要问题是，很多病毒在大肠杆菌中不稳定。由于很多病毒同时具有原核和真核表达的能力，它们在大肠杆菌中的表达产物会影响大肠杆菌的生长。因此，在构建病毒的侵染性克隆中经常会出现含病毒基因组的载体转化大肠杆菌后无法获得克隆菌落，或是获得的克隆菌落发生基因突变(碱基突变、片段缺失)的问题，给病毒侵染性克隆的构建带来了很大的障碍。例如马铃薯Y病毒属的番木瓜环斑病毒和番木瓜畸形花叶病毒，我们多次尝试将它们的基因组导入大肠杆菌，但无法获得序列正确的克隆。

为解决这一障碍，目前有降低大肠杆菌培养温度、尝试不同大肠杆菌菌株、在病毒基因组插入内含子等方法。前两个方法存在效果不普遍或效果不明显的问题，而插入内含子的方法虽然能有效解决病毒毒性蛋白在大肠杆菌中表达的问题，但插入内含子数量及位置的确定需要大量的前期工作或摸索。

因此，现有技术对于未能提供一种简单有效的、解决在大肠杆菌中不稳定的侵染性病毒克隆的方法。

发明内容

针对侵染性病毒克隆构建过程中存在的问题，本发明第一方面提供病毒侵染性克隆的构建方法，包括：将具有病毒基因组的载体转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌，其中，所述具有病毒基因组的载体为采用体外克隆法或体外基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体。

在本发明一个可选的实施例中，所述采用体外克隆或基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体的步骤包括：

1)通过PCR整体或分段(优选为分2-5段)扩增病毒基因组；所得基因组两端或各基因片段两端设计有用于体外拼接反应的15-30bp重叠的接头序列；

2)(通过PCR扩增、酶切等方法)获得线性化表达载体；所得线性化的表达载体两端设计有用于体外拼接反应的重叠序列；

3)通过Gibson拼接或In-Fusion拼接等常规体外接方法使病毒基因组与线性化表达载体进行体外拼接，获得插入或拼接有病毒基因组的载体。

在本发明一个可选的实施例中，本发明第一方面提供一种简单有效的病毒侵染性克隆构建方法具体包括如下步骤：