[发明专利]一种有效的蛇足石杉愈伤组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种有效的蛇足石杉愈伤组织培养方法。

背景技术

蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb)Trev.)为蕨类植物，属石杉(Huperiaceae)，石杉属(Huperzia Bernh)，又名救命王、千层塔、金不换。民间用于治疗痈疖肿毒，跌打损伤等。分布于全国各地，也广布于亚洲其他地区、大洋洲以及中美洲的古巴、墨西哥等地^[1]。多生于山地密林下或沟谷阴湿土中,海拔400m～1600m.群落上层乔木树种主要有毛竹(Phyllostachys heterocyc la)、三尖杉(Cephalotaxus fortunei),灌木树种有木断木(Loropetalum chinense)、金银花(Lonicera japonica)、映山红(Rhododendron mariesii)、紫金牛(Maesa japonica)、格药柃(Eurya muricata),草本植物有蕨、多花黄精(Polygonatum cyrtonema)、三脉紫菀(Aster geratoides)、泽兰(Eupatorium japonicum)及浙皖粗筒苣苔(Briggsia chienii),蛇足石杉伴生植物有金发藓(Polytrichum commune)及暖地大叶藓(Rhodobryum giganteum)等藓类。植株为丛生的草本植物,高10cm～24cm,茎上部为红色或绿色.不定根生于主茎基部,伸入土中或基质.主茎直立,或下部斜升,圆柱形,单一或一至数回二叉分枝,春季其顶端常生有芽胞,外被1个～3个绿褐色卵状披针形芽鳞片,芽胞落地成新苗.叶螺旋状着生,椭圆状披针形,有明显的短柄,叶长1cm～3cm,宽2mm～4mm,顶端锐尖,基部渐狭成楔形,边缘有不规则的尖锯齿；中脉明显；叶薄纸质,两面光滑.孢子叶与营养叶同形或异形,绿色；孢子囊肾形,单生于叶腋间,不集成穗,多生于植株的上部,淡黄色,光滑,成熟时横裂；孢子一型,圆球状四面体^[2]。

蛇足石杉是一种珍贵的药用植物,自1972年国内首次报道该植物的生物碱在动物试验上有横纹肌松驰作用后,已从中分得13个生物碱单体.药理实验证明,石杉碱甲和乙具有很强的抑制胆碱酯酶的活性、提高学习记忆和改善老年人记忆功能的效果,并能用于治疗重症肌无力.鉴于其重要的药用价值,对它的研究已被广泛重视^[2]。

近年来，由于人们认识到：蛇足石杉含有的石杉碱甲具有高抗胆碱脂酶活性，对于改善记忆力，治疗中老年痴呆及重症肌无力具有良好的疗效且毒副作用小，潜在的市场前景广阔，因此，该植物越来越受到人们的重视。但由于蛇足石杉资源分散，而且许多相对集中的产地均位于自然保护区和风景区范围内，同时，蛇足石杉是一种多年生、生长缓慢的小草本，年净生物量的增长速率极为有限，长成一颗高12cm的成苗，在自然条件下大约需要6～7年的时间，资源更新周期较长，不可大规模开采，现有技术中急需一种有效的蛇足石杉愈伤组织培养方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种有效的蛇足石杉愈伤组织培养方法。

其具体技术方案为：

一种有效的蛇足石杉愈伤组织培养方法，包括以下步骤：

步骤1、蛇足石杉茎尖采用洗洁精清洗2次，无菌水清洗4次，采取0.15％升汞液灭菌5min，无菌水清洗4-6次；

步骤2、将步骤1中清洗好的蛇足石杉茎尖在解剖镜下取0.1-0.2mm长的微茎尖；

步骤3、将微茎尖进行蛇足石杉愈伤组织培养，采用MS培养基，加入0.1μM IBA和1.5μM KT以及3mg/L谷氨酰胺，培养条件为25度恒温，14h光周期培养。

进一步，步骤3中培养过程中加入抑制内生菌的方案为：青霉素50000IU/L，链霉素50mg/L，两性霉素B 750μg/L，孔雀石绿1.5-1.8mg/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了迄今为止蛇足石杉人工组织培养的有效方法与技术，出愈率可达25％以上，采用多次灭菌和添加内生菌抑制剂AAS的方法，解决了蛇足石杉愈伤组织培养过程中产生的内生真菌污染问题，有望实现蛇足石杉愈伤组织培养方法上的突破。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.1材料

实验材料采自于江西省庐山，由胡颂平老师2014年12月引种于江西农大温室内。

1.2培养基