[发明专利]一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用等温核酸扩增技术快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法。

背景技术

分枝杆菌属于裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌种类繁多．达150种以上。分枝杆菌属分为结核分枝杆菌复合群[(mycobacteria tuberculosis complex，MTC)，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌]、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌(nontuber culosis mycobacteria，NTM)。即，NTM是结核杆菌及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。NTM可以是致病菌或条件致病菌，包含鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、龟分枝杆菌等10余种。

NTM广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，传播途径主要从环境中获得感染。NTM可侵犯人体肺部、淋巴结、皮肤和软组织，导致NTM病。NTM侵犯肺部则成为NTM肺病，多数由鸟胞内复合体分枝杆菌引起，其次是堪萨斯分枝杆菌。NTM肺病容易被误诊为肺结核病，且疗效较差，根治困难；另外，艾滋病的出现也加剧了NTM肺病的流行。NTM侵犯淋巴结则成为NTM淋巴结炎，主要致病菌有鸟胞内复合体分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌；以颈部淋巴结最常见，亦可累及耳部、腹股沟、腋下淋巴结；多为单侧无痛性淋巴结肿大，常有瘘管形成。NTM侵犯皮肤和软组织则成为NTM皮肤软组织病，主要致病菌有海分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌。局部脓肿多由偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌引起。海分枝杆菌可引起游泳池肉芽肿和类孢子丝菌病。溃疡分枝杆菌可引起Bairnsdale溃疡。堪萨斯、苏加、嗜血分枝杆菌可引起皮肤散播性和多中心结节病灶。NTM病严重危害人类健康，且其疫情呈逐年上升趋势。

在NTM中，鸟胞内分枝杆菌复合体是一类重要的NTM，很多病例都是由鸟胞内分枝杆菌复合体引起，传统的鸟胞内分枝杆菌复合体分离鉴定法通常需要24～48 h才能报告结果，且影响因素多，不适合体检及大规模的诊断、筛查。

近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、多重PCR、Real-Time PCR、基因芯片技术以及等温核酸技术中的LAMP已经建立起来，并且在鸟胞内分枝杆菌复合体的检测中已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。PCR技术以其高度的特异性及灵敏性在鸟胞内分枝杆菌复合体检测方面取得了重大突破。但PCR技术对试验条件要求比较高，需要昂贵的仪器设备和专业人员，且操作相对复杂，更为重要的是检测成本高，往往只有专业检测实验室才能配备，在基层单位难以展开。LAMP技术解决了PCR技术需要昂贵的设备仪器等问题，具有操作简便、结果判断简单等优点。但LAMP技术对引物、靶基因的要求较高，且不能进行定量检测。

由于现存鸟胞内分枝杆菌复合体检测方法的不足以及鸟胞内分枝杆菌复合体快速实地检测的需求，研究一种能在基层应用、可简单快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的扩增方法非常有必要。

本发明中的等温核酸扩增技术不仅检测时间短、灵敏度高，并且摆脱了仪器的束缚，可以在非实验室环境下进行，达到现场检测的目的。此外，该方法操作方便，对人员要求不高。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，该检测方法的主要步骤是先进行鸟胞内分枝杆菌复合体基因组的提取，然后将鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA加入到含有特异引物和探针的等温核酸扩增体系中进行扩增，在等温条件(35-45^oC)下，10-40分钟即可检测扩增产物。

本发明的具体技术方案如下：

1.获取鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA，设计检测鸟胞内分枝杆菌复合体的引物和探针，建立鸟胞内分枝杆菌复合体等温核酸扩增体系，将鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA加入到扩增体系中，再加入反应缓冲液，在等温条件(35-45^oC)下，10-40分钟即可检测到扩增产物。

2.根据上述1所述的方法，建立鸟胞内分枝杆菌复合体等温核酸扩增体系，如下所示：