[发明专利]检测植原体的LAMP引物组及其试剂盒和应用

说明书

本发明公开了检测植原体的LAMP引物组及其试剂盒和应用。本发明首先针对16SrI组植原体16S基因和tuf基因保守序列的6个区域分别设计6组和2组引物，最终得到特异性强的由SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成LAMP引物组。本发明进一步公开了用所述引物组制备得到的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的试剂盒并建立了检测方法，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高等优点，可应用于泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的检测。

技术领域

本发明涉及用于检测16SrI组植原体的LAMP引物组，尤其涉及利用LAMP引物组检测泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的检测方法，还涉及LAMP引物组在泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的早期诊断和病原菌的监测与鉴定中的应用，属于植物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

植原体(Phytoplasma，原称Mycoplasma-like organism简称MLO)，是一类类似植物病原细菌但无细胞壁的原核生物。能引起许多重要的粮食作物、蔬菜、观赏植物和果树等经济林木的严重病害。根据植原体16S rDNA基因序列，可将植原体分为28个组，其中引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变的植原体均属于16Sr I组。此类病害的分布范围广，传播速度快，致病力强，一旦感病，传统的病害防治技术难以治愈。泡桐原产自中国，在中国的栽培面积广泛，是重要的速生丰产用材林，也是重要的行道树和环境美化树种。泡桐丛枝病在中国大面积发生，严重影响树木的生长与发育。桑树萎缩病是一种十分危险的病害，分布在中国江苏、浙江、安徽等省。此病近年来日渐增多，尤其中国江浙江界的太湖地区，每年发病率一般为5-15％，重病区达30％以上，很多病株数年后即枯死。莴苣黄化近来被报道在中国福建发生，发病后严重降低莴笋的产量和品质，给农民们带来严重损失。为了从根本上解决此类病害的防治问题，最有效的措施就是建立严格的植物检疫，从源头上杜绝病原。

植原体病害的检测，前期主要依靠生物学、电镜观察、抗生素试验相结合的传统方法进行检测，到后期随着生物技术的发展，基于酶联免疫反应、核酸杂交以及PCR技术的检测方法也相继建立，检测的灵敏度和准确性不断提高。但是目前的这些方法往往需要昂贵的仪器设备，且操作程序复杂，检测时间长，对检测人员的技术要求较高，这些都大大限制了此类诊断方法的使用和推广。

环介导等温扩增是Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，是一种新型的分子诊断方法。该方法针对靶基因6个特异区域设计特异性引物，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温下对核酸实现扩增。由于该方法具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器、检测周期短和结果可视化的特点，使得其非常适合作为基层和现场的病害诊断方法进行推广使用。

环介导等温扩增作为一种新型的分子诊断方法。已有部分报道将该技术应用于植原体的检测上，如16Sr I组的翠菊黄化和草莓绿瓣植原体、16Sr II组的银胶菊丛枝植原体、16Sr V组的枣疯病和葡萄金黄化植原体、16Sr XII组的番木瓜丛枝植原体等均已开发出相应的LAMP检测方法。但这些方法的靶标基因主要是16S rDNA基因。16S rDNA基因在植原体中为双拷贝，存在一定的变异性，而蛋白延伸因子编码基因tuf在植原体中为单拷贝，被认为是一种新的进化标签。它和16S rDNA基因相比保守性略低，可在16S rDNA基因分组的基础上进一步区分亚组。

因此以tuf基因作为靶标基因，针对泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变等植原体，设计有更好特异性的LAMP引物，对泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的早期诊断和病原菌的监测与鉴定具有十分重要的意义。

发明内容

本发明目的之一是提供泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑萎缩、莴苣黄化和长春花绿变植原体的LAMP引物组；