[发明专利]发酵生产L‑赖氨酸的方法及改造的棒杆菌

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。

背景技术

通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。

产L-赖氨酸的细菌包括棒杆菌属的细菌。例如，中国专利CN1017906B公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含合成二氢二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶的重组DNA的棒状杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1187539A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码天冬氨酸激酶和编码二氨基庚二酸脱羧酶的重组DNA的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1310234A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脱氢酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1890372A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN101065484A公开了具有产生Ｌ－氨基酸的能力的棒菌属细菌，其被修饰使得乙酰辅酶Ａ水解酶活性减少。

中国专利申请CN101855357A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用在编码果糖-PTS酶的ptsF基因上具有突变的谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN104245921A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

上述生产L-赖氨酸的文献都是基于已知生物学功能的酶或基因。

在已经测序完成的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的全基因组（可参见NCBI参考序列：NC_003450.3）中，有约3057个基因。然而，在这些基因中，除了生物学功能明确的基因外，有约1196个基因编码生物学功能不清楚的“假设的蛋白质”。在这些“假设的蛋白质”中，有约236个基因编码的蛋白质被通过生物信息学方法注释以表明它们与某些蛋白质或酶相似，或包含某些结构域。然而，仍旧有约960个基因编码的蛋白质的生物学功能没有被启示生物学功能，也不清楚它们在发酵生产L-赖氨酸中的效用。

本发明人经过长期研究和实践，经历了众多的失败，凭借了一些运气，偶然发现在棒杆菌的染色体中对两个编码“假设的蛋白质”的基因的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量。该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于多种细菌发酵生产L-赖氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：

（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因使得该基因的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，例如可以在该基因中插入无义密码子，也可以敲除该基因。也可以通过改造该基因的调控序列来间接改造该基因，从而使其编码的蛋白质的活性和/或表达量降低。

这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造。因此，在本文中，改造优选是通过同源重组进行的改造，更优选是通过同源重组进行的敲除。