[发明专利]在果蝇细胞中高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法

权利要求书

1.编码在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白的基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.人GAD65蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述基因的如SEQ ID NO.1所示的序列联合StrepII标签克隆到表达载体中，再和抗性质粒同时转染到果蝇细胞中表达，将得到GAD65-StrepII标签融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pAc5.1/V5-HisA。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗性质粒为pCoBlast抗性载体。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述果蝇细胞为S2。

6.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)根据种属偏好性表达，运用软件对人GAD65的ORF序列进行密码子优化；

(2)人工合成全序列；

(3)引物和酶切位点设计：

根据合成的序列和StrepII标签设计引物，并加入KpnI和NotI酶切位点，引物如下所示：

forward primer：

5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCGG-3'；

reverse primer：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’；

(4)PCR扩增获得目的GAD65-StrepII片段；

(5)对目的片段和载体进行双酶切；

(6)酶切后的目的片段和载体在T4连接酶作用下连接；

(7)重组转化:将重组表达载体转染细菌感受态细胞；

(8)测序验证后大量抽提表达GAD65-StrepII的载体；

(9)将GAD65-StrepII载体与pCoBlast抗性载体共转染果蝇细胞表达蛋白；

(10)步骤(9)获得的蛋白经过纯化后获得高纯度GAD65蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)中的载体为pAc5.1/V5-HisA。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(6)利用连接酶进行重组连接：连接片段100ng，加入50ng酶切后的pAc5.1/V5-His A质粒，5μl 2×反应buffer和1μl T4连接酶，补足水到10μl；在22℃连接1h，转化感受态细胞。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(9)的具体过程：

选取培养好的健康的S2细胞，将3×10⁶个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Sf-900II SFM Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；

使用磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染:

①在无菌1.5ml的离心管中依次加入双蒸水233μl，氯化钙240mM 36μl，1μg/μl GAD65-StrepII-pAc5.1/V5-His A质粒19μl，0.5μg/μl pCoBlast质粒2μl；

②缓慢混合1min后转移到含有200μl的2×HEPES HBS的离心管中，混匀；

③将混合物在室温放置30-40min；

④缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；

⑤在28℃的恒温培养箱中培养1天；

⑥对细胞培养基进行换液；

⑦将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；

⑧1000rpm离心3min后，去除上清，并加入1ml新鲜培养基到15ml的离心管中；

⑨将混合物重新加入到新的离心管中；

⑩用2ml培养基重新清洗一次；

用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；

28℃培养两天后加入20μg/ml Blasticidin筛选克隆建立稳定转染细胞系。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(9)转染后的细胞培养在含20μg/ml Blasticidin的Sf-900II SFM Medium中，分为10个细胞三角培养瓶，每瓶200ml培养基培养；细胞培养物收集裂解后，再通过StrepII标签亲和纯化色谱靶向获得。