[发明专利]沙门菌H抗原鉴定用引物

说明书

本发明提供一种沙门菌H抗原鉴定用引物，包括6条上游引物F1‑F6以及31条下游引物R1‑R31，其序列如表1所示；其中F1为R1～R20的共同上游引物；F2为R21～R24的共同上游引物；F3为R25～R28的共同上游引物，F4为R29的上游引物，F5为R30的上游引物，F6为R31的上游引物。F1‑F7的序列分别为序列表中的SEQ NO.1‑SEQ NO.7，R1‑R31的序列分别是序列表中的SEQ NO.8‑SEQ NO.37。本发明以编码沙门菌H抗原的fliC和fljB基因为目标基因，选取其保守片段设计上游通用引物，选取可变片段设计下游特异性引物，建立能高通量鉴别沙门菌H抗原的xTAG磁珠悬浮芯片法，用于沙门菌的血清型别鉴定。除上、下游引物外，无需另外设计探针，并避免了直接杂交法中PCR产物因自我复性而影响杂交的问题，且同时适用于MagPix和Luminex 100/200检测平台。

技术领域

本发明涉及一种用分子方法来鉴定沙门菌H抗原的引物。

背景技术

沙门菌的血清型别与其致病性、耐药性、宿主范围等密切相关，对分离到的沙门菌进行血清学分型，是沙门菌监测中必不可少的工作。传统的沙门菌血清学分型方法是血清凝集试验，先根据其菌体抗原（O抗原）分群，再根据鞭毛抗原（H抗原）分型。因H抗原的特性及血清凝集试验本身的局限性，在实际工作中存在诸多问题：（1）H抗原与相应抗血清呈絮状反应，其反应结果不如O抗原的颗粒状凝集明显，结果判断受个人经验和主观影响较大；（2）部分沙门菌的H抗原需经1次或数次位相诱导后才能凝集，操作繁琐耗时；（3）不同H抗原间常存在交叉凝集反应。随着分子生物学技术的发展，基于DNA分析的沙门菌检测及血清分型方法相继出现，如普通PCR法、荧光PCR法、测序分析等，此类方法均以沙门菌相关特异基因序列为目标，为沙门菌的血清型别鉴定提供了新思路，但大多局限于单个或少数几个血清型的鉴别，难以实现多株菌、多种血清型别的同时鉴定。

基于Luminex xMAP（Flexible Multi-Analyte Profiling）技术的液态悬浮芯片技术，以其高通量、高效率、高灵敏度和高特异性等优点，近年来受到越来越多的关注和青睐，其在沙门菌血清型鉴别中的应用，也逐渐见诸报道。基于美国CDC的研究成果，Luminex公司于近年推出了基于直接杂交法的沙门菌血清分型试剂盒（xMAP SalmonellaSerotyping Assay，SSA），即在上、下游引物扩增范围内，设计1条特异性探针并将之耦联于各荧光编码的普通微珠(不含反TAG序列)上，成为标记微珠，样品经不对称PCR扩增并生物素标记后，与耦联有特异性探针的各标记微珠混合液杂交分型。但该试剂盒所用微珠不带磁性，仅适用于基于流式细胞原理的Luminex 100/200流式荧光检测仪，不能用于基于磁珠捕获与CCD成像的MagPix检测平台。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种沙门菌H抗原鉴定用引物，无需另外设计探针，并避免了直接杂交法中PCR产物因自我复性而影响杂交的问题，且同时适用于MagPix和Luminex100/200检测平台。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

沙门菌H抗原鉴定用引物，其特征在于：包括6条上游引物F1-F6以及31条下游引物R1-R31，其序列如表1所示；其中F1为R1～R20的共同上游引物；F2为R21～R24的共同上游引物；F3为R25～R28的共同上游引物，F4为R29的上游引物，F5为R30的上游引物，F6为R31的上游引物。

F1-F7的序列分别为序列表中的SEQ NO.1-SEQ NO.7，R1-R31的序列分别是序列表中的SEQ NO.8-SEQ NO.37。

进一步地，所述上游引物和下游引物共计37条，被分为2个PCR反应体系，其中，F1、R1～R20为反应体系1中引物，其余均为反应体系2中引物。

进一步地，上述的沙门菌H抗原鉴定用引物采用以下方法进行设计和合成：