[发明专利]用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途

说明书

本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途，其中所述重组质粒包含一个或两个以上相互串联的抗氧化反应元件以及基础转录元件、分泌型荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因。与现有技术相比，本发明采用分泌型荧光素酶作为报告基因，其检测灵敏度高，检测荧光素酶基因活性时无需裂解细胞，实现了抗氧化剂高通量的筛选和比较，以及长期效应的检测，为筛选抗氧化剂或检测抗氧化剂活性提供了一种高效、快速、简便的方法，可应用于具有抗氧化作用天然药物和人工合成的化合物的筛选。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途。

背景技术

人体在受到多种环境因素如紫外照射等情况下，会产生活性氧族(reactiveoxygen species，ROS)。ROS作为第二信使，诱发炎症反应、细胞膜脂质过氧化、蛋白和DNA氧化损伤，直接或间接地破坏细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，进而诱发包括细胞氧化应激损伤或凋亡，进一步导致肿瘤等的形成。当暴露于ROS时，机体自身能诱导一系列保护性蛋白，其中核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,简称Nrf2)信号通路是最为重要的抗氧化应激通路，它可以启动II相酶和抗氧化酶等基因转录，维持体内氧化还原平衡，提高细胞抗氧化应激能力。但损害过量或由于年龄因素导致细胞内源性抗氧化能力下降，细胞中的ROS产生量超出细胞自身清除能力，则导致损伤。因此，采用抗氧化剂诱导II相酶和抗氧化酶等基因的表达和提高细胞内的抗氧化能力是探索安全有效且作用机制明确的抗氧化药物和化妆品行业的重点。

如上所述，Nrf2信号通路是最重要的抗氧化应激通路，激活后的Nrf2，由胞浆转移至胞核，与Maf蛋白形成异二聚体，识别并与核内抗氧化反应元件(antioxidant responseelement,ARE)结合，启动II相酶和抗氧化酶基因转录，维持体内氧化还原平衡，提高细胞抗氧化应激能力。

目前已有报道利用ARE顺式转录原件(cis-regulatory element)调控报告基因来监控Nrf2的转录激活作用，这些报告基因主要包括萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein)、β-半乳糖甘酶(β-galactosidase)等。然而，这些报告系统还存在一系列的问题：(1)以萤火虫荧光素酶等各种酶作为报告基因，后续检测其活性时均需要裂解细胞后检测，操作步骤复杂而不方便，难以实现长期检测；(2)检测灵敏度较差，还有待进一步提高；(3)上述报告基因采用瞬时转染，其中最常用的HaCaT细胞其转染效率非常低(转染效率20％左右)，导致结果不稳定。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便、快速、高效的用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途，从而实现了对能否激活Nrf2通路的抗氧化剂进行高通量的筛选和比较，以及长期效应的检测，而且检测灵敏度可靠、稳定。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

提供用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒，所述重组质粒包含一个或两个以上相互串联的抗氧化反应元件以及基础转录元件、分泌型荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因；所述抗氧化反应元件为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

其中，所述基础转录元件包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，所述分泌型荧光素酶基因是源于Gaussia princeps的分泌型荧光素酶基因。

其中，所述源于Gaussia princeps的分泌型荧光素酶基因包含其野生型序列以及SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。