[发明专利]一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用

说明书

本发明公开了一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用，其扩增步骤包括植物预处理、植物样本总DNA提取、样本16S rRNA基因的扩增和基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析，样本16S rRNA基因的扩增包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析包括植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析。该基因扩增方法用于高通量测序的植物病害检测及植食性动物肠道微生物检测。本发明采用高通量测序技术进行植物内生细菌的测序分析，数据量更大，检测结果更完整，而且最大程度降低了植物宿主的污染，结果多样性更高，而且成本低。

技术领域

本发明涉及基因扩增技术领域，具体是一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用。

背景技术

植物内生菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存的关系。植物内生菌可以产生活性物质作为生物纺织资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有着巨大的应用前景。虽然经过多年的研究，但目前植物内生细菌的研究还是处于初级阶段，对于植物内生细菌在植物中的分布及丰度调查还依赖于传统的分离纯化后使用通量较低的DGGE等方法，即使采用高通量测序进行的相关研究也因为植物宿主本身的质体和线粒体的干扰，造成植物内生细菌的研究始终处在基础研究的水平。

发明内容

本发明的目的在于克服植物内生细菌传统研究方法中需培养分离和植物宿主基因干扰等技术局限，提供一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，具体步骤如下：

(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4-6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；

(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；

(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；

31)16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增

①设计三对引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16SrRNA基因为模板，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，下划线标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429(F/R)引物对用于植物内生细菌16S rRNA基因的扩增；

②配置植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由乳液发生剂和PCR扩增缓冲液构成；

③将步骤②用于扩增植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温；