[发明专利]包载SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球的制备

说明书

技术领域

本发明属于医药制剂技术领域，主要是包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球制剂的制备方法。

背景技术

作为威胁人类身心健康的主要杀手之一，恶性肿瘤的病发率和致死率不断地上升，病患年龄也呈现减小趋势，一旦确诊给患者和家庭乃至社会都会带来极大痛苦与负担。恶性肿瘤的死因顺位在发达国家人口死亡的原因中排列第一位，在发展中国家中位列第二位^[1]。所以癌症的研究和诊治已成为全球性的卫生事业钻研的重点。传统治疗手段以手术联合化疗和放射疗法的方式进行，虽然有一定的治疗效果，但是存在复发率高，对正常组织损伤大，肿瘤治疗针对性差和毒副损伤大等很多不足。很多科研工作者正不断探索和尝试更多新型治疗手段。

肿瘤免疫治疗中经常用到各种细胞因子，它能够广泛调节各种免疫或非免疫细胞的功能，作用于机体的各种系统，增强免疫应答，更好地杀伤肿瘤。但是细胞因子的应用也存在一定的局限性：由于代谢较快，易受环境和蛋白酶影响，在体内维持的时间很短暂，不能稳定维持病灶的有效浓度，甚至可能产生不同程度的毒副损伤；其剂量水平在免疫治疗中起到关键作用：剂量过低会产生免疫耐受，剂量过高、大面积弥散会对机体产生免疫损伤或毒副作用。新型给药体系的研发具有重要意义，是当下研究的热点。

海藻酸钠是一种天然的亲水性线性多糖，经FDA认证为一种安全的化合物，当海藻酸钠分子接触二价阳离子如Ca²⁺、Ba²⁺时可以很快形成囊状结构。包载蛋白的海藻酸钠凝胶可以维持蛋白较高的活性，同时调节其中蛋白类药物的缓慢释放。壳聚糖由于具有易于成膜、生物相容性好、可生物降解、产物无毒无害等特性，广泛应用于医药、化工、食品和环保等不同领域。壳聚糖的氨基可以进行生物素化修饰，也可以与海藻酸钠的羧基发生反应，制备出的海藻酸盐-壳聚糖复合微球。这种复合微球体系可以保护药物免受环境和蛋白酶的影响，满足治疗剂量的同时可以防止短时间浓度过高、弥散造成的损伤。此时，药物的吸收、利用和分布主要取决于载体材料性质，而不是药物本身的性质。海藻酸盐-壳聚糖复合微球还具有维持药物活性、控制药物缓慢释放、延长作用时间和增强靶向性等特性。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte and macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是免疫治疗中较为常用到的一种细胞因子，它可以调节单核、巨噬、造血和嗜中性、酸性粒细胞等多种细胞的生成，并影响其生命周期进程，同时有利于成熟细胞释放到外周血液中，可以提高DC抗原提呈能力，协调CD4⁺、CD8⁺T细胞的功能，和抗体参与的免疫反应。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)对正常组织无害，对肿瘤细胞却可以直接杀伤并且抑制其增殖、生长，TNFα在体内可以使肿瘤细胞逐渐出血坏死，瘤体积逐渐减小甚至消失。

本发明中选择SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα(m代表小鼠，h则代表人)为实验药物，制备了包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球；同时引入了生物素-亲和素反应系统-一分子的亲和素可以强力结合四分子的生物素，借助链霉亲合素(Streptavidin，SA)将微球锚定在肿瘤细胞膜表面，通过持续在病灶局部释放所包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα，从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种制备包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的方法，保证制备出的微球表征指标良好，且制备过程能保持各细胞因子的生物学活性。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

1.空载海藻酸钙微球的制备。进行四因素三水平正交试验确定空载海藻酸钙微球制备的最佳配方。

2.包载蛋白的海藻酸钙微球的制备。向海藻酸钠溶液中加入不同质量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα进行载蛋白海藻酸钙微球的制备，通过比较包封率和载药量确定两种蛋白的最佳投放量。

3.包载蛋白的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的制备。将最佳投放量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα分散到海藻酸钠溶液中，同时将生物素化壳聚糖溶液分散到CaCl₂溶液中，分别制备成w/o型乳液，然后混合，交联固化得到生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球。

附图说明