[发明专利]一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，涉及一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用，具体涉及一种耐高温中性蛋白酶及其编码基因序列、含有该编码基因序列的重组表达载体和转基因重组菌以及该耐高温中性蛋白酶的应用。

背景技术

蛋白酶作为催化蛋白质多肽链中的肽腱水解的一类酶，广泛存在于植物茎叶果实、人和动物内脏及微生物(主要是细菌、真菌和放线菌)。细菌作为微生物蛋白酶的主要来源之一，其合成的蛋白酶具有较强的水解能力，因而在工业生产中具有更加广泛的应用。目前，产蛋白酶细菌研究最深入的是芽孢杆菌，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichniformis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumillus)等；枯草芽孢杆菌作为一种被美国食品药物管理局认可的安全菌种(无致病性、环境友好及抗逆性强)，是蛋白酶制剂大规模产业化的主要菌种，其能够产生酸性、中性及碱性蛋白酶，但以中性及碱性蛋白酶居多。一般而言，真菌合成分泌的蛋白酶种类多于细菌，然而真菌合成分泌的蛋白酶水解能力相对较低，并且稳定性及耐热性较差，产蛋白酶真菌主要有曲霉属和毛霉属，另外还有酵母菌，如嗜热圆酵母、解脂假丝酵母。

相对而言，产蛋白酶的放线菌种类较少，针对其展开的研究和获得的成果也较少，产蛋白酶的放线菌主要有灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、氟氏链霉菌(Streptomyces fradiae)以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。经证实，链霉菌蛋白酶具有较强的热稳定性，能够耐受50℃以上的高温，且对多种金属离子及酶活抑制剂有较强的耐受能力。因此，链霉菌对于新型蛋白酶的研发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶。

本发明的另一目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶编码基因在表达耐高温中性蛋白酶中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明提供的耐高温中性蛋白酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012.01.09，保藏编号为CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)编码序列表中的SEQ ID NO.2氨基酸序列的多核苷酸。

本发明的一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶编码基因序列是通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得，所涉及的实验技术包括链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白酶活性的测定等；具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过PCR扩增获得该蛋白酶编码基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上，并将重组质粒导入到特定的大肠杆菌表达菌株内，进而获得蛋白酶过表达重组菌株，最终通过IPTG诱导实现蛋白酶的体外高效表达，并收集菌体、破碎菌体，离心后获得粗酶液，之后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况， 最后，测定该蛋白酶相关的酶学特征。

从灰略红链霉菌得到的耐高温中性蛋白酶具有以下特征：

1、该耐高温中性蛋白酶的编码基因长度为519bp，共编码172个氨基酸。

2、该耐高温中性蛋白酶的适合反应温度为40～65℃，优选为45～60℃。

3、该耐高温中性蛋白酶的适合反应的pH为5.0～11.0，优选pH为6.0～9.0。