[发明专利]一种灰略红链霉菌果胶酯酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和现代酶工程技术领域，涉及一种灰略红链霉菌果胶酯酶及其编码基因和应用，具体涉及一种果胶酯酶及其编码基因序列、含有该编码基因序列的重组表达载体和转基因重组菌以及该果胶酯酶的应用。

背景技术

果胶酶是广泛存在于果实及多种微生物中，是一类可以作用于果胶质的一类由许多单酶组成的复合酶的总称。果胶酶在苎麻脱胶、木材防腐和酒精发酵等领域具有主要的应用意义，目前已广泛应用于食品行业。

果胶酯酶(EC 3.1.1.11)是一种能催化、水解果胶生产果胶酸和甲醇的酶。果胶酶对聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的专一性，无法催化聚甘露糖醛酸甲酯，但是能够水解聚半乳糖醛酸乙酯、丙酯和烯丙酯，但是水解速度较甲酯低。果胶酯酶能够从果胶分子的还原性末端或其临近的游离羧基开始进攻去甲氧基，沿着分子以单链机制进行，形成对二价阳离子非常敏感的游离态半乳糖醛酸区域。目前，果胶酯酶在食品行业中应用较多，常用于制备低甲氧基果胶及果汁澄清加工。因此，果胶酯酶有着广泛的用途和开发前景，目前新型果胶酯酶的开发和制备已经成为研究的热点。

果胶酯酶来源广泛，细菌、真菌和放线菌都能产生果胶酯酶，但是能产生果胶酯酶并成功应用于工业生产的实例却还很少。研究表明，链霉菌是合成果胶酯酶的理想菌株。本发明针对克隆自灰略红链霉菌的新型果胶酯酶，经密码子优化后对其进行原核表达分析及初步酶学性质分析，为该果胶酯酶的异源重组表达及生产利用提供了有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰略红链霉菌果胶酯酶。

本发明的另一目的在于提供一种果胶酯酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的果胶酯酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种上述的果胶酯酶编码基因在表达果胶酯酶中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种上述的果胶酯酶在水解果胶中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种灰略红链霉菌果胶酯酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明提供的果胶酯酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期：2012.01.09，保藏编号为CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1经密码子优化后得到的SEQ ID NO.2的核苷酸序列；

(3)编码序列表中的SEQ ID NO.3氨基酸序列的多核苷酸。

本发明所述的果胶酯酶基因序列是通过全基因组测序、密码子优化及全基因人工合成的方式获得。本发明涉及的实验技术包括灰略红链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及重组果胶酯酶活性的测定等，具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过密码子优化及基因人工合成的方式获得该基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上，并将重组质粒转入到特定的大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)内，进而获得果胶酯酶表达菌株，最终通过IPTG诱导实现果胶酯酶的体外高效表达，最后收集菌体、细胞破碎，离心后获得粗酶液，之后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot检测表达情况，最后测定该果胶酯酶相关的酶学特征。

从灰略红链霉菌得到的果胶酯酶具有以下特征：

1.该果胶酯酶的编码基因共有1101个核苷酸，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，共编码366个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.该果胶酯酶的适合反应温度为45～65℃，优选为55℃。

3.该果胶酯酶的适合反应的pH为7～10，优选为8。