[发明专利]一种富含AT或者GC基因的合成方法

权利要求书

1.一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于包含以下步骤：

步骤一：将基因的正义链人工或者利用软件分割成A1，A2…At的多个寡核苷酸片段；将基因的反义链人工或者利用软件分割成B1, B2…Bt的多个寡核苷酸片段；设计的An和对应的Bn寡核苷酸片段能够互补配对产生带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，其中以An的方向计，双链寡核苷酸片段An/Bn的3’端粘性末端和双链寡核苷酸片段An+1/Bn+1的5’端粘性末端能互补配对，且粘性末端长度为2 (n+1) 个碱基,n表示1,2,3，……，t；

步骤二: 获得步骤一中的寡核苷酸片段；

步骤三：分别将An，Bn的寡核苷酸链分段慢退火形成双链寡核苷酸片段；

步骤四：将步骤三中所获得的双链寡核苷酸片段利用磷酸化酶进行磷酸化；

步骤五：将步骤四中所获得的各个磷酸化双链寡核苷酸片段利用连接酶，连接成一条完整的基因；

其中，所述富含AT或者GC基因是指基因中AT含量超过60%的基因或者GC含量超过60%的基因。

2.根据权利要求1所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于所述的t选自大于等于1且小于等于15的整数。

3. 根据权利要求1~2中任一项所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于所述的寡核苷酸片段的长度为20-150 bp。

4.根据权利要求1或2所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于步骤三中所述的分段慢退火是将不同的寡核苷酸对An/Bn，加入不同的反应管中，单独退火；包括首先用85℃-95℃高温将寡核苷酸对变性5-15 min, 再将变性后的寡核苷酸对置于低于30℃的条件下自然冷却，或以每分钟降低0.1-0.2℃的方式缓慢冷却退火。

5. 根据权利要求4所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于权利要求4中所描述的寡核苷酸片段退火包括以下步骤：将1ul 寡核苷酸片段An, 1 ul寡核苷酸片段Bn, 10 ul 2×SSC 缓冲液，8 ul H₂O加入到1.5 ml 反应管中, 混合均匀后，95 ℃变性5min, 室温冷却30 min – 1 h；其中寡核苷酸片段An和寡核苷酸片段Bn的初始浓度均为50uM。

6.根据权利要求2所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于步骤四所述的磷酸化包括以下步骤：从步骤三退火形成的A1/B1，A2/B2…At/Bt双链寡核苷酸片段中各取1 ul, 加入T4 PNK激酶 2ul，T4 PNK激酶buffer 2ul , 补充水至20 ul， 37℃反应0.5h。

7.根据权利要求1所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于双链寡核苷酸片段A1/B1的5’端和At/Bt的3’端根据后续的克隆需求分别设计产生平末端或者带有目标载体上用于载体上特定的限制性内切酶克隆的粘性末端。

8.根据权利要求7所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于磷酸化产物连接过程包括以下步骤：从磷酸化产物中取5 ul，加入1 ul酶切的目标载体，10 ul2×连接酶buffer，3 ul H₂O,室温反应0.5 h。

9.根据权要求7所述的一种富含AT或者GC基因的合成方法，其特征在于双链寡核苷酸片段A1/B1的5’端和At/Bt的3’端设计产生平末端时磷酸化产物的连接过程包括以下步骤：从磷酸化产物中取5 ul，加入1 ul 线性化的平末端目标载体，10 ul 2×连接酶buffer，3ul H₂O，室温反应0.5 h。