[发明专利]高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及假单胞菌基因工程菌株及其构建方法，尤其是一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

我国常见的农作物病害生物达1600种，每年造成的损失约为1000亿人民币，严重地影响了我国农业的发展。近些年，化学农药的大规模使用导致了病虫害的抗药性不断增强。此外，高浓度和毒性的化学农药的应用，对农田、水环境也造成了很大的污染，严重威胁着我国的粮食安全和生命健康。因此，低毒性、低残留和不易产生抗药性的生物农药获得了各国政府和农药企业的极大关注。

与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中，上海交通大学彭华松课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA，CAS号为2538-68-3)，定名为“申嗪霉素”，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证。

但最近相关研究发现，与PCA相比，另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。据报道，目前能合成PCN的微生物菌株有绿针假单胞菌PCL1391，铜绿假单胞菌PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但由于PCN产率较低，尚未能大规模推广应用。上海交通大学彭华松课题组对筛选的一株绿针假单胞菌HT66进行基因工程改造后，PCN的产量已经达到1800mg/L并申报了中国发明专利(CN201310566864.5)，但是该产量距离PCN的工业化应用还存在一定的距离。因此，通过基因工程技术进一步改造该菌株将有利于提高PCN产量，实现其农业应用。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法，克服现有菌株生产吩嗪-1-甲酰胺产量和效率较低的缺陷，提供一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；

或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。

优选地，所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述基因工程菌株为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的parS基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。