[发明专利]用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法

说明书

本发明提供了一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。具体地涉及一种改进的重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。该建库方法包括：单细胞裂解；重亚硫酸氢盐处理；以重亚硫酸氢盐处理产物为模板的一链及二链合成；以及以二链合成产物为模板构建测序用文库。其中在重亚硫酸氢盐处理后的纯化步骤中，加入了tRNA，提高了处理产物的纯化及回收效率。采用本发明的文库构建方法，减少了样本的损失，提高了测序数据的比对率。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体地说，涉及一种用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。

背景技术

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组DNA的一种重要的表观遗传学修饰，即在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团共价结合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。DNA甲基化在维持高等生物正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、衰老以及人类肿瘤的发生等生物学过程中起着重要作用。在无脊椎动物中，基因组DNA甲基化通过调控基因的表达模式，参与调节机体对环境的适应过程。因此，获得全基因组范围内所有胞嘧啶位点的甲基化数据，对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。

现有的Bisulfite Sequencing(重亚硫酸氢盐测序)将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，经PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来。Bisulfite处理与高通量测序技术相结合，可精确分析每一个C碱基的甲基化状态，从而来绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联，为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。

当前普遍采用的方法是从大量的组织样品中获取基因组DNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的甲基化修饰差异。并且，在健康组织或肿瘤等病变组织中，某些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。

Sebastien等提出了单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序技术，流程包括：

(1)采集单细胞；

(2)将采集的单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；

(3)将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；

(4)以上述的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；

(5)使用链霉亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；

(6)以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及

(7)以所述合成的第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。

但是，该方法做出的实验分析结果中，数据的比对率(Unique Mapped Ratio)较低。

参考文献

[1]Sébastien Smallwood SA,Lee HJ et al.2014.Single-cell genome-widebisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.Nature methods,8,11(8):817-820.

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，以及用于测定单细胞基因组DNA样本的甲基化位点的试剂盒。以提高数据比对率(Unique Mapped Ratio)。