[发明专利]链霉菌重组质粒pIJ8600‑attM及其构建方法和其应用

权利要求书

1.一种重组质粒，其特征在于：所述质粒是基于大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600，采用限制性酶切以及DNA连接原理，插入了功能性的解酯酶基因attM片段构建而成；它包含来源于pUC18质粒的DNA复制起点(ori)、便于在大肠杆菌与链霉菌中筛选的阿泊拉霉素(Apra)抗性标记aac(3)IV、便于接合DNA转移到受体细胞的源于RK2质粒的转移起点(oriT)、多个限制性酶切位点组成的多克隆位点(MCS)、紧挨着多克隆位点(MCS)上游的由硫链丝菌素诱导驱动的强启动子tipAp以及位于多克隆位点(MCS)下游的转录终止子tfd以防止转录的通读；它还包含如上所述的解酯酶基因attM。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述多个限制性酶切位点包括NdeI，XbaI,BamHI,BglII。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述解酯酶基因attM的核苷酸序列见DNA序列数据库Genbank，登录号U59485，该基因全长为771bp，G+C含量为57％，编码256个氨基酸的解酯酶蛋白。

4.一种根据权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：经PCR扩增从根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58菌株得到的解酯酶基因attM编码区序列(CDS)与NdeI/BglII双酶切后的pIJ8600载体进行连接，获得携带attM的重组质粒pIJ8600-attM，插入的attM编码序列置于tipAp启动子之下，受硫链丝菌素的驱动而表达。

5.根据权利要求4所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：该构建方法的具体步骤为：

步骤a，attM基因片段的克隆：

采用逆转录-PCR技术从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58中扩增得到；用质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带，其中，琼脂糖凝胶电泳采用DNA凝胶回收试剂盒，DNA溶于pH为8.0、浓度为10MTris-HCl缓冲液中，贮于-20℃；

步骤b，限制性酶切：

上述纯化的PCR产物进行Nde I和Bgl II双酶切,酶切产物经质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳、切胶回收；

pIJ8600质粒用Nde I和Bgl II双酶切；酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳、切胶回收；

步骤c，酶切的pIJ8600质粒与attM基因的连接：

酶切的attM基因片段与同样酶切的pIJ8600质粒进行DNA连接，16℃温育过夜；

步骤d，转化大肠杆菌DH5α克隆宿主：

上述全量连接反应产物通过化学转化法转入E.coli DH5α中；

步骤e，菌落PCR以及测序验证：

挑取LB/Apra平板上转化子10个，振荡培养6–8h,取1μl菌液作为模板进行菌落PCR鉴定；

经菌落PCR鉴定正确的转化子进行所插入基因attM的测序。

6.一种根据权利要求1所述的重组质粒在链霉菌QS信号分子γ-丁内酯的降解中的应用。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：包括：

(1)将其转化非致病性链霉菌(non-pathogenic Streptomycetes)，然后返接到敏感宿主，以携带pIJ8600-attM质粒的非致病性链霉菌为媒介，发挥群感淬灭作用，精准摧毁病原链霉菌的致病性；

(2)携带pIJ8600-attM质粒的非致病性链霉菌用于空气、水体等环境中，某些放线菌所产有毒次生代谢物之清除。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述用途(1)中，所述病原链霉菌为疮痂链霉菌。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述用途(2)中，所述放线菌为灰黄链霉菌，其产有毒次生代谢物为缬氨霉素valinomycin。