[发明专利]体外检测免疫细胞杀伤效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体地，涉及体外检测免疫细胞杀伤效率的方法。

背景技术

治疗肿瘤是人类的最大挑战，通常需要采用综合治疗方法，包括手术切除肿瘤、放疗、化疗，但这些方法存在肿瘤迁移与复发的危险，而且具有严重损伤正常组织和免疫功能的副作用。半个世纪生命科学积累表明肿瘤实际上是机体免疫系统不能监护和清除时时刻刻在突变细胞的积聚，从而蚕食正常机体机能，最终危机患者的生命。而提高机体免疫力治疗肿瘤则成为现代生物学对肿瘤治疗最大贡献，细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和杀伤功能，清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防复发及转移，达到根治肿瘤的目的，具有特异性强、毒副作用小等特点。从而成为肿瘤综合治疗的一个必不可少的组成部分，其中肿瘤细胞免疫治疗是一种崭新的、最具有显著疗效的肿瘤治疗方式之一。

根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗，或特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。目前肿瘤细胞免疫治疗研究主要集中在过继性免疫治疗，利用体外扩增的免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、DC细胞、NK细胞、基因修饰的T细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL细胞)等进行肿瘤的治疗。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的，是继传统疗法(手术、化疗和放疗)、靶向疗法后肿瘤治疗领域又一项突出有效的治疗方式。

肿瘤细胞免疫治疗是现在科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法。具体涉及的是通过一定手段采集或分离得到人体自身免疫细胞，经过体外诱导、培养后，得到数量增多、靶向杀伤性增强的各种免疫细胞(如CIK细胞、NK细胞、TIL细胞、DC细胞等)，这些细胞可释放穿孔素/颗粒酶，穿孔素在癌细胞表面穿孔，使颗粒酶进入细胞内诱导癌细胞凋亡；或者分泌大量细胞因子，直接作用癌细胞或激活其他免疫细胞杀伤癌细胞，把这些免疫细胞回输到人体，达到杀灭血液和组织中的癌细胞。这种方法打破免疫耐受，激活和增强机体自身的免疫能力，达到治疗和保健的双重功效。

淋巴细胞作为免疫细胞中最重要的一类，是现今肿瘤免疫细胞治疗研究中的焦点。当淋巴细胞在体外与靶细胞接触时，可表现出破坏和溶解靶细胞的特性，称为淋巴细胞毒作用(cytotoxicity)。靶细胞可以是肿瘤细胞或其它组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子破坏靶细胞。淋巴细胞毒性实验是评价体外培养淋巴细胞对靶细胞杀伤效率的重要方法。常规采用的操作方法是把淋巴细胞与人白血病细胞系K562进行共培养，检测经过淋巴细胞杀伤后残余K562细胞的活性来反映淋巴细胞的杀伤效率。其中存在的问题是K562细胞是血液系统肿瘤细胞系，呈悬浮状态，并且在细胞大小上，与淋巴细胞差别不是很明显，这就造成我们只能通过检测残余K562细胞的活力来反映淋巴细胞的杀伤效率。这就造成实验结果不太稳定，操作不简便易行。

因此，本领域迫切需要开发一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。

本发明的第一方面提供了一种非治疗性和非诊断性的检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：

(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；

(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和

(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

在另一优选例中，在步骤(iii)之前,还包括用洗脱法处理免疫细胞的步骤。

在另一优选例中，在向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞之前，对所述肿瘤细胞进行计数。

在另一优选例中，设立对照组，所述对照组中仅含有肿瘤细胞，不含有所述免疫细胞，计算对照组中肿瘤细胞的数量。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)，用其他检测方法进一步测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。