[发明专利]一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用

说明书

本发明公开了一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用，该lncRNA过表达的病毒载体感染的人真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表达量显著降低，显著抑制了胶原合成量。该lncRNA及其过表达的病毒载体可用于制备抑制真皮成纤维细胞合成胶原的药物，为抑制疤痕增生提供了新的靶点。

技术领域

本发明涉及基因工程、细胞学领域，具体地说涉及一种人lncRNA及其病毒载体在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用。

背景技术

增生性疤痕是指皮肤真皮层受损后的愈合期间，胶原局部过量沉积形成突出于皮肤表面的增殖性疤痕组织。皮肤损伤及外科手术后，疤痕的总体发病率为40％～70％，烧伤患者的发病率高达91％。增生性疤痕是烧伤外科和整形外科界面临的巨大挑战，因其不仅影响美观，特殊部位的疤痕还会影响患者的生活质量，给他们带来生理和心理的双重压力。目前，虽然有手术切除、压力治疗、局部皮质激素注射等方法治疗疤痕，但是均存在局限性或不良并发症，无法从根本上阻止疤痕产生。目前已知增生性疤痕形成的病理学本质是真皮层中细胞外基质的过量沉积，其主要成分是由真皮成纤维细胞合成的胶原，尤以I、III型胶原为主。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种特异高表达于真皮成纤维细胞胶原合成的分离lncRNA及其的引物对，以及含有前述过表达lncRNA的病毒载体及宿主细胞；本发明还有一个目的是提供前述lncRNA、病毒载体、宿主细胞在制备抑制真皮成纤维细胞胶原合成药物中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种分离的lncRNA，含有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。所述lncRNA的转录本核苷酸序列位于人的第7号染色体上COL1A2基因5’端上游位置，与COL1A2为天然反义(Natural Antisense)的关系。增生性疤痕形成的病理学本质是真皮层中细胞外基质的过量沉积，其主要成分是由真皮成纤维细胞合成的胶原(collagen)，尤以I、III型胶原为主。本发明是基于增生性疤痕的形成机制，采用lncRNA芯片(lncRNA Array)技术筛选获得特异高表达于真皮成纤维细胞胶原合成的人lncRNA。目前没有关于该lncRNA相关的报道。

所述SEQ ID NO.1的序列为：

CCUGGACCUAGAAACAAAAAAUGAAAGUGGAGAAAACCAAACAAGAAUCUUUCUUUCUUAAAGUAAACAUCGGACUGACAUCUCCUUUCAAACAUUCAUUGAGGAUCUACUCUGUGAGAAGAAGCAAUACCAUGUUAUCUCAUUCUAGUUCCAGUUCUAGUUGACUUGAUUGUCAAACGACUGCUAAGAAGGUGAAAUAGAGGAGAUGACAUGAAUGAGGGACUACAUUGGAAUGAAGAAGAACCUGGAGGAGGUAAAAAAACUGAAGGCUCCGGAUGUCGGACGAUGGAAAAUAAAAACAACAAGCAAGUGAAACUCCCUGACUUAUCAACCUUACUCAAGAAUUCCUUCU

本发明通过构建慢病毒过表达质粒载体，经包装、感染，来干扰人真皮成纤维细胞的胶原合成，从而抑制疤痕增生。所述的病毒载体含有前述lncRNA序列。具体地说，先提取人离体增生性疤痕组织的lncRNA，合成cDNA第一链，然后设计引物PCR扩增所述lncRNA，在反应体系中与双酶切扩增序列和载体，建立连接反应；然后转化、筛选阳性克隆、抽提质粒并测序验证。接着转染慢病毒表达质粒、包装质粒，获取病毒上清液后，过滤冻存。

其中，扩增所述lncRNA的引物对分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，经设计分别含有BamHI和EcoRI酶切位点：

上游引物：5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3’；