[发明专利]特异捕获并重复复制低频率DNA碱基变异的方法及应用

说明书

本发明公开了一种特异捕获并重复复制低频率DNA碱基变异的方法，属于分子诊断领域其步骤包括：（1）对DNA进行热变性，然后用具有热力学动态结构的引物混合物对目标DNA进行杂交，然后重复复制；（2）利用与测定目标3´端匹配的寡聚核苷酸对重复复制的次生DNA片段进行特异性延伸、加尾，并在其3´端引入一段共同序列；（3）构建测序文库；（4）生成多个测序读值；（5）鉴定测序读值与参考序列之间的序列差异；（6）判定是否为序列变体；本发明可对于低频率DNA碱基变异的检测灵敏度可以达到0.01%，对在正常序列背景中可能含有少量变异序列的样品中的低频率核酸变异的鉴定和阐明，以及对在测序错误背景下的低频变异的鉴定有极大的帮助。

技术领域

本发明涉及分子生物学及临床诊断领域，尤其涉及利用结构性引物从碎片DNA样本中捕获目标DNA、重复复制、扩增后直接用于二代高通量平行测序仪测定，以鉴定DNA片段中超低频率变异的碱基替换、缺失、插入或混合型突变组合等DNA序列突变的方法及其应用。

背景技术

肿瘤组织的癌基因变异是驱动肿瘤细胞恶性增生的主要因素。大多数肿瘤的癌基因除了存在一个主要的驱动变异以外，还存在多种较低频率的其它驱动变异，而这些较低频率的其它驱动变异对肿瘤的治疗效果有很大的影响，这些变异是肿瘤分子病理检测的主要对象，是肿瘤靶向治疗的基础。

正常人外周血血液中存在微量的游离DNA片段(cell-free DNA，简称cfDNA)。在生理或病理变化时，通过血浆样本可以测定出相关病理或生理组织细胞特异的cfDNA，因此，cfDNA可以作为病理生理改变时的“液态活检”检测对象。液态活检以血液中的游离DNA为检测对象,具有非介入性、可重复取样、接受度高等特点，已经成为无创产前遗传诊断、肿瘤诊断、肿瘤预后等研究领域的热点，并开始进入临床应用。cfDNA的鉴定在肿瘤的早期诊断、药效评估、靶向治疗及预后评估等领域也有着广阔的应用前景。

新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、胸水、血浆、肿瘤脱落细胞中肺癌相关的基因突变检测已经应用于指导个性化靶向用药，并得到如cFDA、FDA及欧盟药监机构的认可。截止2016年4月，FDA等管理机构认定的肺癌靶向用药的伴随诊断基因已有：EGFR、Kras、Braf、Nras基因的突变热点、PIK3CA基因、EML4-ALK融合基因、ROS1、ALK/ROS1、BCR-ABL融合基因，PDGFRA、JAK2、C-KIT突变基因等。肿瘤学领域，对这些基因突变热点的液态活检可能用于监测血液中的肿瘤载荷，如对缺少组织活检诊断的肺癌患者血液样本中表皮生长因子受体(EGFR)驱动突变的检测已被药监机构批准用于EGFR-酪蛋白激酶抑制剂类药物的伴随诊断方法。然而，基于血液中DNA分析的液态活检方法作为常规癌症诊断应用之前，还必须解决其有效性、操作性和可靠性的问题，但液态活检在肿瘤的早期诊断、药效评估及预后评估等领域已经凸显出特殊的应用前景【Diehl F,Schmidt K,Choti MA,et al.Circμlatingmutant DNA to assess tumor dynamics.Nat Med 2008；14(9):985-90】。

技术上，由于血液中游离核酸含量低，而且游离核酸易受野生型核酸的稀释干扰，并受到传统检测技术灵敏度的限制，液态活检在临床应用中受到了一定的限制。就突变点频率测定的灵敏度而言，qPCR技术可以达到0.1％、数字式PCR为0.01％、二代高通量平行测序(简称，二代测序)可达到0.001％的水平。如果以血浆中cfDNA为检测样本，对突变检出技术的灵敏度要求非常高，要求达到0.01％，按照这种要求，目前只有二代测序技术勉强可以用于cfDNA的高通量测定。而由于测序深度和文库背景信号的障碍，基于二代测序技术的液态活检方法目前还只适用于科研，距临床诊断应用还有一段距离。