[发明专利]一种DNApulldown方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于研究DNA与蛋白相互作用的DNA pulldown方法及试剂盒。

背景技术

随着功能基因组学的兴起，蛋白质-DNA相互作用的研究变得越来越重要。蛋白质-DNA相互作用涉及很多生物学功能，如基因调节、DNA修复和DNA重组(ROHS R,JIN X,WEST S M,et al.2010.Origins of specificity in protein-DNA recognition.Annu Rev Biochem[J],79:233-269)。现有研究DNA-蛋白相互作用的技术方案有多种，如酵母单杂交(Y1H)方法、ChIP-seq方法、凝胶迁移实验(EMSA)和DNA pulldown方法。

DNA pulldown方法是一种非常重要的蛋白质-DNA相互作用的研究方法。该方法可以在同一个样品中分离DNA-蛋白复合体。通常，是通过高亲和性的标签(如生物素)标记DNA，标签的目的是固定DNA，通过琼脂糖珠子或磁珠可以分离出生物素化的DNA，从而分离出细胞裂解液中的DNA-蛋白复合体。分离出的蛋白进行洗脱后可以通过Western Blot进行检测，或通过质谱进行筛选(DENG W G,ZHU Y,MONTERO A,et al.2003.Quantitative analysis of binding of transcription factor complex to biotinylated DNA probe by a streptavidin-agarose pulldown assay.Anal Biochem[J],323:12-18)。

DNA pulldown方法具有很多优点，如可以富集低丰度的靶标，可以通过多种方法构建尾端标记的DNA，可以分离出完整的DNA-蛋白复合体，可以联合Western Blot或质谱进行分析等。随着DNA pulldown技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。

Kazuhito Yamashita等报道在血管内皮细胞中，通过DNA pulldown实验发现，在低氧情况下HIF-1结合ET-1基因的启动子区域，启动ET-1的表达。进一步的研究发现ET-1启动子中的HIF-1结合区不足以应答低氧反应，还需要附近额外的50bp的序列帮助，此区域包括AP-1、GATA-2、NF-1的结合区。证实了AP-1、GATA-2、NF-1可以稳定HIF-1与ET-1启动子的结合，进一步招募p300/CBP形成ET-1低氧应答复合体(YAMASHITA K,DISCHER D J,HU J,et al.2001.Molecular regulation of the endothelin-1gene by hypoxia.Contributions of hypoxia-inducible factor-1,activator protein-1,GATA-2,AND p300/CBP.J Biol Chem[J],276:12645-12653)。

Deng WG等使用双生物素化的环氧化酶2(COX-2)的启动子作为探针，开展DNA pulldown，检测了经过不同处理的人类成纤维细胞的细胞核提取物，发现佛博尔酯或肿瘤坏死因子alpha处理后DNA探针与p300和PCAF的结合增加，但是不影响与Srb7、Med7或TFII(B)的结合，证实在肿瘤中p300和PCAF通过结合COX-2的启动子启动COX-2的表达。

但是，DNA pulldown实验还存在很多缺点，如DNA探针与蛋白结合的特异性不高，实验过程还会受到核酸酶污染的影响。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种DNA pulldown方法及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种DNA pulldown方法，包含以下步骤：

S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；

S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；

S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取的核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；