[发明专利]一种串联RAD标签测序文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA遗传标记及DNA甲基化检测技术领域，具体涉及一种串联RAD标签测序文库的构建方法。

背景技术

近些年来，高通量测序技术的迅猛发展极大地推动了动植物基因组学研究的深度和广度。简化基因组技术是利用限制性内切酶降低基因组复杂度的基因组测序分析技术。由于其使用一定大小的酶切片段所对应的序列作为整个基因组序列的部分代表，降低了基因组的复杂性并且成本低、不依赖于参考基因组信息，这些优势使得对基因组信息相对匮乏的非模式生物开展组学分析成为可能，已被广泛的应用于遗传图谱构建、数量性状定位、群体遗传学分析、系统进化分析和辅助基因组组装等研究中。目前限制性酶切位点相关DNA测序技术(restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq)是该领域内的代表性技术。但由于RAD技术建库流程复杂，片段长度不一等，许多改进技术应运而生。其中基于ⅡB型限制性DNA内切酶的2b-RAD技术，可产生等长的33bp标签，具有一致的扩增效率，不仅可以提高分型准确率，还能通过选择性碱基实现标签密度的灵活控制，能适用于不同的研究方向和需求，具有更为广泛的应用前景。其后发展的MethylRAD技术进一步将该类技术的应用方向拓展至表观遗传领域，该技术利用甲基修饰依赖型内切酶(Mrr-like enzyme)可产生等长标签的特性，通过对获取甲基化标签的高通量测序，实现全基因组范围DNA甲基化的精确定量。

随着二代测序技术平台的技术革新和快速发展，在相同数据量的前提下，长读长相比短读长具有更低的测序成本及更广泛的应用。已有的2b-RAD或MethylRAD技术的局限性在于，因其文库构建所产生的标签长度较短(～35bp)，仅能被用于单端35-50bp测序，而无法被应用于更具成本优势的双末端长读长测序(如PE100-150bp测序)。

另外，在基因表达分析领域中应用的基因表达系列分析技术(serial analysis of gene expression,SAGE)是将转录本的代表标签连接形成长短不一的多联体分析，但该技术无法有效控制串联标签的数目以及标签的连接顺序，并且对串联DNA序列的分析方法也是克隆到质粒载体中进行测序分析，并未提出在二代测序平台上实现顺序串联三个以上标签的测序文库构建方案，并且测序文库可同时实现SNP分型和甲基化检测。

发明内容

为解决上述难题，本发明提出了一种串联RAD标签测序文库的构建方法，可实现对多个标签构建串联测序文库，解决了2b-RAD或MethylRAD技术无法应用于双末端测序平台的局限，使得标签测序成本大大降低，实现对全基因组范围遗传标记和表观遗传变异进行高通量、低成本地筛查和检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种串联RAD标签测序文库的构建方法，步骤为：

1)酶切：利用选定内切酶对N个基因组DNA分别进行酶切反应，获得N份酶切片段，所述N为大于2的整数；

2)接头连接：对所述N份酶切片段分别连接接头，即设计N对接头组合，得到N份连接产物，每份酶切片段两端连接的接头均设计有SapI酶的酶切位点和用于实现标签串联的特征序列以及扩增引物结合的通用序列，根据所添加的接头决定了N组酶切片段的串联顺序；

3)连接产物扩增：将步骤2)所得到的N份连接产物分别利用不同的生物素引物和普通引物组合进行PCR扩增，富集连接有接头的酶切片段，切胶回收PCR产物，采用同样的方法扩增4-8个循环，扩增后得到N份富集的PCR产物；将所述N份富集的PCR产物等量混合，并进行纯化；

4)串联标签文库：利用SapI酶对混合并纯化后的N份PCR产物进行酶切，切除了酶切片段两端通用的接头和引物序列，使接头上带有的特征序列保留并形成末端粘性突出，N份PCR产物形成了可直接串联的标签，根据接头上的特征序列互补配对，使N份标签文库按照顺序依次串联，得串联长标签；

5)串联长标签富集：将所述串联长标签经凝胶纯化后利用引物进行PCR扩增，引入barcode构建串联标签文库；

6)文库测序：将所述串联标签文库利用Illunima测序平台进行测序。

为了实现对识别位点的上下游双链产生切割，产生具有粘性末端的33-35bp长度的等长标签，所述步骤1)中内切酶是IIB型限制性内切酶、甲基修饰依赖型内切酶中的一种或几种。