[发明专利]一种基于特异性SS-COI引物的花蓟马PCR快速检测方法

说明书

本申请提供了花蓟马特异性SS‑COI引物，包括：Fi63‑4F:5'‑CGCTAAGTATTTTAATTCGG‑3’(SEQ ID No.1)；Fi63‑4R:5’‑AGTGGCACTAGTCAGTTTCC‑3’(SEQ ID No.2)。本申请还提供了包含本申请所述的引物的用于特异性检测花蓟马的试剂盒。本申请还提供了本申请所述的引物或本申请所述的试剂盒在特异性检测花蓟马中的应用。本申请还提供了一种基于特异性SS‑COI引物的花蓟马PCR快速检测方法，包括：1)提取样品DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用本申请所述的引物进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及花蓟马特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒以及基于花蓟马特异性SS-COI引物的PCR检测方法。

背景技术

花蓟马(Frankliniella intonsa)又叫台湾花蓟马，隶属于缨翅目(Thysanoptera)，蓟马科(Thripidae)，花蓟马属(Frankliniella)，在我国及世界大部分地区都有分布(韩运发，1997)。花蓟马为多食性害虫，其寄主范围十分广泛，能危害多种作物、蔬菜及花卉植物，是农林作物的重要害虫之一。

花蓟马通过取食和传播病毒使农作物大量减产，造成巨大的经济损失(Lewis,1997；Nagata and Peters,2001)。花蓟马对寄主植物的危害方式有两种：直接危害和间接危害。直接危害是花蓟马以锉吸式口器刺吸寄主植物的叶、花、果实等器官，叶部受害后呈现银白色条斑，严重的枯焦萎缩；叶基部受害呈银灰色，可导致植物落叶，影响生长。花蓟马有很强的趋花性(段半锁和吕佩珂,1995)，多种植物的花均可被其危害。花蓟马成虫、若虫多群集于花内取食为害，损害繁殖器官；害后出现点或横条状斑纹，花器、花瓣受害后成白化，经日晒后变为黑褐色，危害严重的花朵萎蔫以致干枯；导致农产品生产减产、价值降低，造成严重经济损失。间接危害是花蓟马通过传播多种植物病毒进行为害。病毒通过花蓟马成虫取食而传播到健康植株上，使病毒迅速扩散蔓延，造成为害。病毒传播一般可致作物损失30％-50％，严重时可达到70％，甚至有可能导致绝收(Lima.,2004)。可见，花蓟马通过传播病毒危害造成的经济损失远远大于其直接取食造成的危害(Lewis,1997；Nagata andPeters.,2001)。由于花蓟马体型较小，活动较为隐蔽，种类鉴别必须将虫体制成玻片标本，然后再显微镜下观察其特征并加以鉴别；而且，蓟马近缘种之间的区别特征少且不明显，传统方法容易造成错误鉴别。国内外许多研究者 利用不同的分子标记进行物种的鉴定。如Moritz(2000)，以ITS-RFLP法鉴别多种蓟马，林峻贤(2003)利用基于28SrDNA和16SrDNA的Multiplex-PCR及PCR-RFLP技术来鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)和棕榈蓟马(Thrips palmi)。Asokan等(2007)，利用COI基因设计出棉蓟马和棕榈蓟马的特异性引物。游中华等(2007)用PCR产物直接测序法对入侵害虫西花蓟马和其他8种蓟马的线粒体COI基因433bp片段测序，表明基于PCR及直接测序技术的分子鉴定可以达到准确鉴定蓟马物种之目的。

准确的物种鉴定是物种检疫、分布调查及种群发生动态研究的前提，也是深入开展生物学、综合防治等研究的基础。Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用物种特异性COI引物(SS-COI)，根据预期DNA条带的有无来鉴定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速、简便等优点，目前物种鉴定多选择该基因作分子标记(Hebert等,2003；肖金花，2004；Savolainen等，2005)。

花蓟马是新疆地区棉花及多种农林作物上重大的害虫，目前在新疆地区，相关研究报道较少，SS-COI方法尚未在花蓟马的检测方面得以应用。

发明内容

本申请提供了花蓟马特异性SS-COI引物，包括：