[发明专利]一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测黄曲霉毒素M1的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测黄曲霉毒素M1的方法。

背景技术

时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，TRFIA是用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测等方面有较为广泛的应用。

由于稀土元素络合物的荧光强度都较低，因此需要采用荧光增强技术来提高检测灵敏度。目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型，解离再增强技术、Cyber Fluor系统和基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了稀土元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将稀土元素及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围。

黄曲霉毒素M1属于黄曲霉毒素中的一种，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。其物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒法破坏。哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素M1。黄曲霉毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素M1于1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为一类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。目前亟待获得快速、简便、可靠、准确地检测黄曲霉毒素M1的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的、缺乏快速、简便、可靠、准确地检测黄曲霉毒素M1的方法不足，提供一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测黄曲霉毒素M1的方法。所述的方法能够快速、可靠、准确地检测黄曲霉毒素M1的含量，并且灵敏度高、重复性好、稳定性高、节约时间。该方法能够广泛用于商业化对黄曲霉毒素M1的检测。

本发明通过对纳米微球时间分辨荧光探针的结构，尤其对其组成部分纳米荧光微球的制备原料中稀土元素离子、β-二酮类螯合剂和荧光增强协同剂的摩尔比特殊选择为1∶3∶3，使制备的纳米荧光微球的荧光强度极大，有利于提高利用含有该纳米荧光微球的纳米微球时间分辨荧光探针检测黄曲霉毒素M1含量的灵敏度、准确性和可靠性。

本发明的技术方案是：一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测黄曲霉毒素M1的方法，其包括以下的步骤：

(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；

(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶3∶3；

(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和黄曲霉毒素M1单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-黄曲霉毒素M1探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；

(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-黄曲霉毒素M1探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；

(5)利用黄曲霉毒素M1制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；

(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；

(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；

(8)向步骤(7)的酶标板的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。

本发明中，较佳地，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：